p16、p53及hTERC在HPV檢測(cè)陰性子宮頸鱗癌中的表達(dá).pdf

1、宮頸癌是全球女性中第二最常見的惡性腫瘤，占所有癌癥的9.8％。全球每年約有500000宮頸癌新發(fā)病例，其中一半的人死于宮頸癌，而80%的死亡發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家。HPV感染一直以來被認(rèn)為是宮頸癌形成的主要致病因素，其中起關(guān)鍵作用的是致癌基因 E6、E7。然而，許多研究顯示存在約10%的子宮頸腺癌和一定比例的子宮頸鱗癌HPV檢測(cè)為陰性。
　　p53作為一個(gè)腫瘤抑制因子，它是控制細(xì)胞增殖的最主要因子之一。HPV E6致癌蛋白通過E6 AP

2、與p53結(jié)合形成復(fù)合物，導(dǎo)致p53的下調(diào)；在正常的細(xì)胞中，p16是一個(gè)增殖的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，它通過一個(gè)負(fù)性反饋環(huán)一旦Rb基因產(chǎn)物失活就使 CDK4下調(diào)。E7與 pRb蛋白相互作用可以使這個(gè)負(fù)反饋環(huán)失活，導(dǎo)致p16上調(diào)，從而促進(jìn)細(xì)胞周期從G1到S期。如今端粒酶的作用也被認(rèn)為是宮頸癌形成或發(fā)展的主要因素。有研究表明在人惡性腫瘤和被轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞系中端粒酶可被激活，從而得出在人惡性腫瘤的形成中端粒酶的激活是一個(gè)關(guān)鍵事件。端粒酶包括 hTERC和 h

3、TERT兩個(gè)亞基，前者在端粒延長(zhǎng)期間作為模板，后者起催化作用，并具有逆轉(zhuǎn)錄活性。hTERC基因的擴(kuò)增能阻止細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。HPV E6可激活hTERT來維持端粒的長(zhǎng)度，從而導(dǎo)致細(xì)胞的永生化，導(dǎo)致腫瘤的形成。
　　然而，臨床實(shí)際工作中卻發(fā)現(xiàn)存在 HPV DNA及 E6/E7mRNA均為陰性的宮頸癌病例。本研究通過對(duì) HPV DNA、E6/E7 mRNA及 p16、p53、hTERC進(jìn)行檢測(cè)，旨在探討HPV檢測(cè)陰性SCC

4、的存在，并深入分析三個(gè)指標(biāo)在HPV檢測(cè)陰性SCC中的表達(dá)及意義。
　　目的：
　　通過對(duì)HPV DNA、E6/E7mRNA的檢測(cè)，從而得出人類乳頭狀瘤病毒（human papilloma viruse,HPV）檢測(cè)陰性子宮頸鱗癌的存在；檢測(cè)p16、p53、hTERC在HPV檢測(cè)陰性子宮頸鱗癌中的表達(dá)情況，探討其與HPV檢測(cè)陰性子宮頸鱗癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性，為研究HPV檢測(cè)陰性子宮頸鱗癌的發(fā)病機(jī)制及治療提供新的方向。
　

5、　材料及方法：
　　1.研究對(duì)象：本研究收集的樣本均來自河南省人民醫(yī)院（河南省鄭州市）病理科檔案室，為2013年10月-2015年05月經(jīng)福爾馬林溶液固定、石蠟包埋的宮頸組織標(biāo)本。所選的病例其年齡大致在18-65歲之間，其中位年齡約為42歲。這些病例所對(duì)應(yīng)的病人之前未曾檢查過或者未發(fā)現(xiàn)患有宮頸疾病。收集宮頸組織蠟塊875例。本研究已通過河南省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)的同意并取得了病人或病人家屬的同意及簽字。
　　2.研究方法：應(yīng)用

6、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色法對(duì)875例石蠟包埋的宮頸組織進(jìn)行處理，染色結(jié)果由三名病理科年資較高的診斷醫(yī)生進(jìn)行評(píng)估，最后綜合三名醫(yī)生的評(píng)估結(jié)果做出最后診斷，診斷結(jié)果分為四組：225例正?；蜓装Y病變(normal or inflammatory,NNL)；低級(jí)別宮頸鱗狀上皮病變（The Low Level of Cervical Squamous Intraepithelial Lesion,LSIL）總共

7、有210例，高級(jí)別宮頸鱗狀上皮病變（ The High Level of Cervical Squamous Intraepithelial Lesion,HSIL）總共有200例，宮頸鱗狀細(xì)胞癌(Squamous Cell Carcinoma of The Cervix,SCC)總共有240例。排除225例NNL病例。分別應(yīng)用PCR-反向雜交法、bDNA技術(shù)對(duì)210例LSIL、200例HSIL及240例SCC宮頸組織樣本進(jìn)行HPV型別

8、及E6/E7 mRNA的檢測(cè)，隨后對(duì)15例HPV（-）（15例DNA-/mRNA-）及25例HPV（+）（包括5例DNA-/mRNA+、20例DNA+/mRNA+）SCC樣本進(jìn)行p53、p16免疫組化染色及hTERC基因的FISH檢測(cè)。
　　3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：本研究采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件（美國(guó)SPSS公司）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用χ2檢驗(yàn)、Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)等方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，其中P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

9、>　　結(jié)果：
　　1.HPV DNA檢測(cè)結(jié)果:本研究對(duì)650例宮頸組織樣本進(jìn)行HPV DNA檢測(cè)及分析。HPV總檢出率是94.62%（615/650）；LSIL、HSIL、SCC中，HPV檢出率分別是95.24%（200/210）、100%（200/200）、89.58%（215/240），其中后者較前兩者低，三者之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.00）；LSIL組與 HSIL組、LSIL組與SCC組、HSIL組與SCC組分別進(jìn)行比

10、較，結(jié)果顯示差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　2.宮頸組織中E6/E7 mRNA的表達(dá)情況:E6、E7是HPV致癌的關(guān)鍵基因，當(dāng)HPV DNA整合入宿主細(xì)胞基因時(shí)可導(dǎo)致E6、E7過表達(dá)，因此E6/E7 mRNA的檢測(cè)可表明HPV的感染狀態(tài)。本研究數(shù)據(jù)顯示：各病變級(jí)別之間，E6/E7 mRNA百分比存在明顯差異，具有正相關(guān)性（r=0.39，P=0.00）。對(duì)LSIL組與HSIL組、LSIL組與SCC組、HSIL組與SCC組中

11、的mRNA百分比分別進(jìn)行比較，結(jié)果顯示第一組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.054）,LSIL與SCC、HSIL與SCC之間的mRNA百分比均存在明顯差異（P<0.001）。
　　3.HPV DNA與E6/E7 mRNA的相關(guān)分析:本研究對(duì)SCC病例中HPV DNA及E6/E7 mRNA進(jìn)行分析,結(jié)果顯示存在87.5%DNA+/mRNA+病例、6.25%DNA-/mRNA-病例、2.08%DNA+/mRNA-病例、4.17%DNA-/

12、mRNA+病例。而對(duì)于 HSIL來說， DNA+/mRNA+病例百分比在 SCC中相對(duì)較高，而DNA-/mRNA-病例百分比在 SCC中相對(duì)較低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。
　　4.HPV DNA與E6/E7 mRNA的差異分析:本研究對(duì)各宮頸病變級(jí)別中的HPV DNA陽性率及E6/E7 mRNA陽性率進(jìn)行對(duì)比分析。對(duì)于本實(shí)驗(yàn)中650例宮頸組織樣本來說，HPV DNA、E6/E7 mRNA的檢出率分別是94.62%、

13、71.54%，兩者之間進(jìn)行比較分析，結(jié)果是具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的（P<0.001）。LSIL中，HPV DNA檢出率大于 E6/E7 mRNA檢出率，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.001）；與 LSIL中的差異相類似，HSIL中的HPV DNA檢出率也大于E6/E7 mRNA檢出率，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.001）；在SCC中，HPV DNA陽性率小于E6/E7 mRNA陽性率，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.008）
　　5.p53、

14、p16及hTERC基因的檢測(cè)結(jié)果:本研究對(duì)HPV（-）組和HPV（+）組的SCC宮頸組織樣本均進(jìn)行了p53、p16免疫組化染色和hTERC基因的FISH檢測(cè)，結(jié)果顯示：p53在HPV（-）組和HPV（+）組的陽性百分比分別為66.67%、40%，兩組之間p53陽性百分比無明顯差異（χ2=2.667，P=0.102）；兩組中， p16陽性百分比分別為66.67%、100%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（校正χ2=6.72， P=0.01）。hTER

15、C基因檢測(cè)結(jié)果顯示：hTERC基因陽性表達(dá)率分別為66.67%HPV（-）組、80%HPV（+）組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（校正χ2=0.32，P=0.572）。
　　結(jié)論：
　　1.存在HPV DNA及E6/E7 mRNA均為陰性的子宮頸鱗狀細(xì)胞癌，即HPV檢測(cè)陰性子宮頸鱗狀細(xì)胞癌。
　　2.與HPV檢測(cè)陽性SCC相比，HPV檢測(cè)陰性SCC的形成中p53、hTERC表達(dá)無明顯差別，而p16表達(dá)較弱,其臨床意義和機(jī)制需要進(jìn)一