PP2A甲基化調控在細胞氧化應激中的作用研究.pdf

1、目的:蛋白磷酸酶2A(PP2A)可以在亮氨酸甲基轉移酶1(LCMT1)的催化作用下發(fā)生甲基化，在蛋白磷酸酶甲基酯酶1(PPME1)的催化作用下發(fā)生去甲基化，這種可逆性的甲基化作用在調控細胞生長代謝和有絲分裂中具有重要作用。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)細胞氧化應激可以引起PP2A甲基化狀態(tài)發(fā)生改變，然而其中潛在的效應關系和調控機理尚不明確。本研究通過構建PPME1和LCMT1穩(wěn)定高表達的細胞株，為后續(xù)從細胞和分子水平研究PP2A甲基化調控在細胞氧化

2、應激中的作用提供有力的研究工具;并利用構建好的LCMT1高表達細胞株，探討LCMT1高表達在細胞氧化應激中的作用及其機制。
　　方法:
　　1、構建PPME1及LCMT1高表達HEK293細胞株
　　(1)以pcDNA3.0和pEGFP-N1為載體分別構建重組質粒PPME1-pcDNA3.0、PPME1-pEGFP-N1、LCMT1-pcDNA3.0和LCMT1-pEGFP-N1;采用脂質體轉染法分別將這些重組質粒轉染

3、到HEK293細胞構建穩(wěn)定高表達細胞株PPME1-293、PPME1-GFP-293、LCMT1-293和LCMT1-GFP-293，并轉染空載體做為對照組細胞株pcDNA3.0-293和pEGFP-N1-293。(2)采用熒光顯微鏡觀察PPME1-GFP和LCMT1-GFP熒光融合蛋白的表達并計算轉染效率;使用G418篩選陽性細胞;采用Q-PCR分析PPME1和LCMT1基因mRNA的表達;采用Western Blot檢測PPME1(

4、或PPME1-GFP)和LCMT1（或LCMT1-GFP）及去甲基化PP2Ac蛋白的表達。(3)采用激光共聚焦顯微鏡觀察PPME1-GFP（或LCMT1-GFP）在細胞核和細胞質中的分布情況。
　　2、研究LCMT1高表達在細胞氧化應激中的作用及其機制
　　使用H2O2同時處理pcDNA3.0-293和LCMT1-293細胞誘導建立氧化應激模型，采用刃天青法檢測兩株細胞在模型中的細胞活性變化;采用JC-1染料試劑盒檢測模型中

5、兩株細胞的線粒體膜電位變化;采用WesternBlot分析模型中兩株細胞去甲基化的PP2Ac、磷酸化的mTOR及其底物P70S6K1和4E-BP1等蛋白的表達情況;并使用PPME1特異性抑制劑AMZ-30和mTORC1通路特異性抑制劑Rapamycin對氧化應激模型進行處理以分析其中的分子調控機理。
　　結果:
　　1、PPME1及LCMT1高表達HEK293細胞株的構建
　　(1)各細胞株PPME1或LCMT1蛋白的

6、表達檢測及其功能鑒定:PPME1-293（或PPME1-GFP-293）細胞內PPME1（或PPME1-GFP）蛋白的表達量明顯高于對照組細胞pcDNA3.0-293（或pEGFP-N1-293），并且去甲基化PP2Ac蛋白的表達量也明顯高于對照組細胞的表達(P＜0.05)，提示高表達的PPME(或PPME1-GFP)蛋白具有催化PP2Ac去甲基化的功能;LCMT1-293(或LCMT1-GFP-293)細胞內LCMT1（或LCMT1-

7、GFP）蛋白的表達量明顯高于對照組細胞pcDNA3.0-293（或pEGFP-N1-293），而去甲基化PP2Ac蛋白的表達量低于對照組細胞的表達(P＜0.05)，提示高表達的LCMT1（或LCMT1-GFP）蛋白具有催化PP2Ac甲基化的功能。
　　(2) PPME1-GFP和LCMT1-GFP融合蛋白核質分布:PPME1-GFP融合蛋白主要分布在細胞核中，核質比約為2.5∶1，與原生的PPME1在細胞內的分布一致;LCMT1-

8、GFP融合蛋白在細胞核和細胞質中均有分布，核質比約為0.95∶1，與原生的LCMT1在細胞內的分布一致。
　　2、LCMT1高表達在細胞氧化應激中的作用及其機制研究1
　　(1) H2O2誘導PP2Ac去甲基化:H2O2可以誘導PP2Ac發(fā)生去甲基化，LCMT1高表達和PME-1抑制劑AMZ-30處理均能不同程度的抑制這種去甲基化作用。(2) LCMT1高表達拮抗H2O2對細胞的損傷作用:H2O2刺激對HEK293細胞的活性

9、具有損傷作用，使用AMZ-30預處理細胞不影響這種損傷作用;而相同濃度H2O2作用下，LCMT1-293的細胞活性明顯高于對照組細胞pcDNA3.0-293(P＜0.05)，提示LCMT1高表達拮抗H2O2對細胞的損傷作用。(3) LCMT1高表達保護mTORC1信號通路的磷酸化作用:Rapamycin和H2O2處理HEK293細胞均可以明顯抑制mTOR及其下游底物P70S6K1和4E-BP1的磷酸化作用;而相同濃度Rapamycin或

10、H2O2作用下，LCMT1-293細胞內磷酸化蛋白P-mTOR，P-P70S6K1和P-4E-BP1的表達水平要明顯高于pcDNA3.0-293細胞的表達(P＜0.05)，提示LCMT1高表達保護mTORC1信號通路的磷酸化作用。(4) LCMT1高表達保護細胞線粒體膜電位:相同濃度H2O2作用下，LCMT1-293細胞線粒體膜電位的喪失程度明顯小于對照組細胞pcDNA3.0-293的喪失程度(P＜0.05)，提示LCMT1高表達保護細

11、胞線粒體膜電位。
　　結論:(1)本研究成功構建PPME1及LCMT1穩(wěn)定高表達的HEK293細胞株（即PPME1-293和LCMT1-293），以及帶熒光標志GFP的PPME1及LCMT1穩(wěn)定高表達的HEK293細胞株(即PPME1-GFP-293和LCMT1-GFP-293)。(2)在氧化應激條件下，LCMT1高表達可能通過調控PP2Ac甲基化保護mTOR及其下游底物P70S6K1和4E-BP1的磷酸化作用來保護細胞線粒體功能