MTB特異性蛋白CFP10和ESAT6在結核診斷中臨床應用及作用機制的研究.pdf

1、背景：
　　自古以來，結核分枝桿菌(MTB)作為一種具有極強傳染性的微生物，引起的結核病一直威脅著人類以及許多其他動物的健康。據(jù)最新統(tǒng)計,全球新增約960萬人/年感染活動性結核桿菌，有近150萬人/年死于結核病及其相關并發(fā)癥。在感染初早期快速且準確的檢出結核桿菌及早開始治療可大大降低結核在人群中的播散。作為近幾年來快速發(fā)展的、可檢測抗原特異度細胞免疫應答反應的新技術，ELISP OT已被證明可用于診斷結核的活動性與潛伏性感染。但基

2、于該原理的診斷試劑鮮有新的改進。主要由于該檢驗方法的主要影響條件尚不夠明確。全基因組表達譜芯片技術是近幾年來逐步發(fā)展成熟的一種可以在同一時間檢測大量基因的表達的新的檢測方法，其具有高通量和高靈敏性的特性。當前主要的研究集中在ELISPOT是否可以正確快速的診斷不同人群、不同種類的結核，對于如何提高其診斷性能的研究較少。
　　目的：
　　驗證重組特異性蛋白ESAT-6及CFP-10的生物活性，建立具有較高靈敏度和特異性的ELI

3、SPOT方法。以基因芯片為基礎，通過生物信息結果分析探討影響結核特異性蛋白ESAT-6及CFP-10作用于特異性T淋巴細胞的主要機制。
　　方法：
　　以聚合酶鏈反應（PCR）擴增CFP-10及ESAT-6基因片段，構建原核表達重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒轉化后,經(jīng)IPTG誘導表達后通過親和層析法純化CFP10和ESAT6重組蛋白，分別分析其蛋白純度。通過條件梯度的摸索建立可應用于臨床的ELISPOT方法確定適合的ELISPOT方法實

4、驗條件。
　　通過磁珠分選技術分選出CD4陽性的淋巴細胞，選取合適的表達譜基因芯片，篩選出蛋白刺激前后顯著差異表達的基因位點，根據(jù) GO分析及 KEGG分析，預測其對應的通路。為今后的實驗建立起對應的結構布局。
　　結果：
　　1.本實驗室現(xiàn)已構建穩(wěn)定的特異性蛋白表達體系,根據(jù)實驗條件建立了ELISOPT技術檢測結核桿菌感染的一系列實驗步驟。
　　2.與T-Spot試劑盒進行對比，ELISPOT的特異度與靈敏度分

5、別為82.35％和88.50%(χ2=0.57，P＞0.05)，差異無統(tǒng)計學意義。
　　3.通過芯片檢測刺激前后結核病人T細胞的差異位點，CFP-10刺激后表達上升相對應基因參與BP的GO條目共1138條，參與CC的GO條目共31條，參與MF的GO條目共59條；表達下降相對應基因參與BP條目共1273條，參與CC條目共154條，參與MF條目共181條。ESAT-6刺激后表達上升相對應基因參與BP的GO條目共1295條，參與CC的G

6、O條目共112條，參與MF的GO條目共71條；表達下降相對應基因參與BP條目共1089條，參與CC條目共112條，參與MF條目共139條。
　　4.聯(lián)合KEGG與差異表達基因的分析,上升和下降的通路中，CFP-10組與結核及IFN-γ相關的信號通路如下細胞因子受體相互作用、Toll樣受體、JAK-STAT、細胞粘附等；ESAT-6組與結核及IFN-γ相關的信號通路如下JAK-STAT、Toll樣受體、NF-κB、PI3K-Akt等