蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體中20-kb DNA來(lái)源的初步研究.pdf

1、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis,簡(jiǎn)稱(chēng) Bt)重組菌株HD73(pHC39)能同時(shí)產(chǎn)生雙金字塔形和立方體形伴孢晶體，其晶體蛋白分別僅由rylAc和cry2Aa基因編碼形成。本研究對(duì)雙金字塔形和立方體形伴孢晶體進(jìn)行選擇性溶解和層析，使兩種晶體蛋白-20 kb DNA復(fù)合物成分得到有效純化，并分別抽提了其中的 20-kb DNA 片段混合體(20-kb DNA fragments，20-kb DNAs)。在此基礎(chǔ)

2、上，利用己報(bào)道的僅定位于蘇云金芽孢桿菌庫(kù)斯塔克亞種 (Bt subsp.kurstaki)HD73染色體和75 kb內(nèi)源大質(zhì)粒上的相關(guān)基因作為遺傳標(biāo)記，利用PCR檢測(cè)手段對(duì)同一親本菌株中與雙金字塔形和立方體形伴孢晶體復(fù)合存在的兩種20-kb DNA的來(lái)源進(jìn)行了分析。 1．蘇云金芽孢桿菌重組菌株HD73(pH039)的構(gòu)建以Bt 4.0718 菌株雙金字塔形伴孢晶體中20-kb DNA 為模板，在獲得cry2Aa基因編碼區(qū)約1.9

3、 kb 序列的基礎(chǔ)上，采用cry2Aa基因的特異性引物對(duì)cry2Aa基因的全長(zhǎng)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將所得到的片段用合適的限制性?xún)?nèi)切酶酶切后連入與之具有互補(bǔ)粘末端E.coli-B.thuringiensis穿梭載體pHT304 中，獲得重組質(zhì)粒pHC39。pHC39 經(jīng)電轉(zhuǎn)化入Bt庫(kù)斯塔克亞種(Bt subsp．kurstaki)HD73菌株中構(gòu)建重組菌株HD73(pHC39)。cry2Aa基因在HD73(pHC39)中得到高效表達(dá)，產(chǎn)

4、生典型立方體型伴孢晶體，Cry2Aa蛋白表達(dá)量占總蛋白量的64.2％。 2．重組菌株HD73(pHC39)晶體的選擇性溶解及層析純化對(duì)HD73(pHC39)菌株產(chǎn)生的兩種形態(tài)的伴孢晶體分別在不同的條件下進(jìn)行選擇性溶解，發(fā)現(xiàn)CrylAc和Cry2Aa晶體蛋白均與20-kb DNA相結(jié)合。將溶解的雙金字塔形晶體復(fù)合物于NaCO<,3>/HC1(pH9.5) 緩沖體系，0-1 mol遞增的Cl<'->梯度洗脫條件下進(jìn)行離子交換層析，立

5、方體形晶體復(fù)合物于NaCO<,3>/NaOH(pH11.5)緩沖體系進(jìn)行分子篩層析，得到相對(duì)純化的晶體蛋白復(fù)合物，并從中分別抽提出與CrylAc 和 Cry2Aa蛋白結(jié)合的20-kb DNA。 3．對(duì)HD73(pHC39)中與CrylAc和Cry2Aa蛋白相結(jié)合的20-kb DNA的來(lái)源分析采用定位于Bt庫(kù)斯塔克亞種(Bt subsp．kurstaki)染色體基因組的16srRNA 的編碼基因RRA和定位于HD73菌株內(nèi)源75

6、kb大質(zhì)粒的cryl1Ac基因?yàn)檫z傳標(biāo)記，以?xún)煞N不同形態(tài)伴孢晶體中20-kb DNA為研究對(duì)象，以PCR檢測(cè)技術(shù)為研究手段對(duì)其來(lái)源進(jìn)行探索。結(jié)果在兩種 20-kb DNA 上均檢測(cè)到RRA基因和crylAc基因的存在，確定20-kb DNA來(lái)源于親本菌株內(nèi)源大質(zhì)粒和染色體，且兩種20-kb DNA 在目前的研究范圍尚未出現(xiàn)差異。 4．20-kb DNA上染色體基因的鑒定采用相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)中已公布的蘇云金芽孢桿菌5.2 Mb染色體DN