Periostin在狼瘡性腎炎腎小球病變中的作用及機制.pdf

1、目的:本研究擬以狼瘡性腎炎模型MRL/faslpr小鼠和小鼠系膜細胞為研究對象，探討periostin在狼瘡性腎炎腎小球系膜細胞增殖和細胞外基質增生中的作用及其可能的作用機制，并采用電穿孔技術對小鼠進行活體轉染，檢測敲低periostin表達對小鼠腎小球病變和腎功能的改善情況，為狼瘡性腎炎的病因研究和靶向治療提供依據。
　　方法:1.狼瘡性腎炎模型小鼠腎組織periostin、PCNA、Fn、TGF-β1的表達水平檢測
　　

2、2.體外培養(yǎng)小鼠系膜細胞增殖和細胞外基質增生水平的檢測及與periostin表達水平的關系
　　3.敲低MRL/faslpr小鼠腎皮質periostin的表達，檢測小鼠腎臟細胞增殖和細胞外基質增生水平及蛋白尿水平的變化
　　4.PDGF誘導periostin在體外培養(yǎng)小鼠系膜細胞的表達及與PI3K/Akt信號通路的關系
　　結果:1.Periostin、PCNA和Fn、TGF-β1在LN組小鼠腎組織的表達水平升高。(1

3、)與Control組相比，LN組小鼠血BUN水平明顯增高，血Scr水平無明顯改變，24小時蛋白尿水平明顯增高。(2)光鏡下觀察，與Control組相比，LN組小鼠腎小球體積增大，細胞數增多。PAS染色顯示對照組沒有明顯的細胞外基質積聚，而在狼瘡性腎炎模型組小鼠腎小球細胞外基質積聚明顯增加。(3)免疫熒光檢測顯示，在Control組小鼠腎組織中，periostin在腎小球細胞的細胞漿中微弱表達，而在LN組小鼠腎小球細胞的細胞漿中表達明顯增

4、強;免疫組化顯示PCNA陽性信號在Control組和LN組小鼠腎小球細胞核均有表達，后者表達明顯強于前者。Fn在Control組小鼠腎小球中無明顯表達，在LN組腎小球、腎小管及間質中有明顯的陽性表達。TGF-β1在Control組小鼠腎小球中無明顯表達，而在LN組腎小球中有明顯的陽性表達。(4)Western blot結果表明，與Control組相比，LN組小鼠腎皮質periostin、PCNA、Fn、TGF-β1蛋白的相對表達量均顯著

5、高于Control組。(5)ELISA結果顯示，與Control組相比，LN組血清PDGF-BB水平明顯增高。
　　2.Periostin作為PDGF的下游因子上調體外培養(yǎng)小鼠系膜細胞的增殖水平和增加細胞外基質合成。(1) PDGF時間依賴性上調periostin蛋白表達。Western blot結果顯示，PDGF刺激組periostin蛋白表達顯著高于Control組。PDGF刺激2h后periostin水平開始升高，并于6h達

6、到高峰，12h periostin水平明顯回落;細胞免疫熒光檢測結果顯示，在對照組，periostin在胞漿微弱表達，PDGF刺激組periostin在胞漿表達明顯增強。(2)PDGF上調小鼠系膜細胞增殖水平和細胞外基質表達。Western blot結果顯示，PDGF刺激組PCNA蛋白表達顯著高于Control組，PDGF刺激2h后小鼠系膜細胞PCNA水平開始升高，并于6h達到高峰;12h明顯回落;PDGF刺激組小鼠系膜細胞Fn、TGF

7、-β1蛋白表達明顯升高，PDGF刺激4h后Fn、TGF-β1蛋白表達明顯增加，6h仍明顯增高，12h明顯回落。(3)periostin表達質粒使系膜細胞periostin、PCNA表達明顯增強，Fn、TGF-β1蛋白表達明顯增加。Western blot與免疫細胞化學檢測結果顯示與未轉染細胞和轉染空質粒細胞相比，轉染periostin表達質粒的小鼠系膜細胞periostin蛋白表達明顯增高，同時PCNA的表達明顯增強，Fn、TGF-β1

8、蛋白表達明顯增加。(4)periostin沉默質粒部分逆轉PDGF引起的系膜細胞增殖和細胞外基質表達。Western blot和細胞免疫熒光檢測結果顯示，與PDGF刺激的未轉染組和轉染空質粒組比較，轉染sh-periostin質粒使periostin的蛋白表達顯著下降，并使PCNA的蛋白表達明顯下降。Westernblot結果顯示periostin沉默質粒下調PDGF引起的Fn、TGF-β1蛋白表達。
　　3.敲低periosti

9、n表達有效降低LN組小鼠腎小球細胞增殖和細胞外基質增生水平及尿蛋白水平。(1)sh-periostin質粒有效下調狼瘡模型小鼠腎皮質periostin蛋白表達。免疫熒光和Western blot檢測結果顯示，與LN組和LN+sh-NC組小鼠相比，sh-periostin組小鼠腎小球periostin蛋白的表達明顯降低。(2)敲低腎組織中periostin表達降低了狼瘡模型小鼠腎小球細胞增殖水平。肉眼觀察，MRL/faslpr各組小鼠腎臟

10、體積、質量均無明顯變化。光鏡下觀察，與LN組和LN+shNC組相比，sh-periostin組小鼠腎小球細胞數目有所減少，但仍高于Control組。免疫組化和Western blot檢測結果顯示，與LN組和LN+sh-NC組小鼠相比，sh-periostin組小鼠腎小球PCNA蛋白的表達明顯降低。(3)敲低腎組織中periostin表達能夠降低狼瘡模型小鼠腎小球細胞外基質增生水平。PAS染色結果顯示，與LN組和LN+sh-NC組小鼠相比

11、，sh-periostin組小鼠腎小球系膜區(qū)細胞外基質積聚減少，但仍高于Control組。免疫組化和Western blot檢測結果顯示，與LN組和LN+sh-NC組小鼠相比，sh-periostin組小鼠腎小球Fn、TGF-β1蛋白表達明顯降低。(4)敲低腎組織中periostin表達能夠降低狼瘡性腎炎模型小鼠尿蛋白水平。生化檢測結果顯示，與LN組小鼠相比，sh-periostin組小鼠24h尿蛋白量明顯降低，血Scr、BUN水平無明

12、顯變化。
　　4.PDGF通過激活PI3K/Akt信號通路來誘導periostin的表達，從而進一步引起系膜細胞增殖和細胞外基質表達增加。(1)PDGF促進小鼠系膜細胞中PI3K/Akt信號通路的活化。Western blot結果顯示，PDGF刺激小鼠系膜細胞后30min p-Aktser473出現表達高峰，2h和4h時表達仍持續(xù)升高，6h開始明顯下降，仍高于對照組，至12h時，p-Aktser473表達水平回落至正常水平。(3)

13、PI3K/Akt信號通路抑制劑LY294002能夠抑制PDGF誘導的p-Aktser473、periostin、PCNA、Fn、TGF-β1的表達。Western blot結果顯示，與PDGF刺激組相比，PDGF+ LY294002組較PDGF+DMSO組p-Aktser473、periostin、PCNA、Fn、TGF-β1表達明顯降低。
　　結論:1.狼瘡性腎炎模型小鼠腎組織中periostin，PCNA、Fn、TGF-β1的

14、表達水平明顯升高，而采用電穿孔轉染技術沉默腎組織中periostin表達能夠降低腎小球細胞增殖水平，減少細胞外基質積聚，減輕蛋白尿，提示periostin可能通過上調系膜細胞增殖和細胞外基質增生水平參與狼瘡性腎炎的發(fā)病及病變過程。
　　2.PDGF誘導periostin在體外培養(yǎng)的小鼠系膜細胞表達增加，并上調系膜細胞增殖水平和細胞外基質表達水平。periostin表達質粒促進體外培養(yǎng)的小鼠系膜細胞增殖，細胞外基質合成增加。peri