抗胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素(TSLP)全人源單鏈抗體的篩選及特性分析.pdf

1、目的:抗體針對相應抗原具有高度的特異性和親和性，使抗體在疾病的診斷和治療中顯示出了其他類型藥物無可比擬的優(yōu)勢?？贵w藥物經(jīng)歷了多克隆抗體、單克隆抗體、基因工程抗體三個階段。多克隆抗體來自于B細胞產(chǎn)生的抗體混合物，親和力相對較高但特異性不好;單克隆抗體來自于單個B細胞，特異性強純度高但多為鼠源性抗體，對于人體存在排斥反應;基因工程抗體又稱重組抗體，是利用重組DNA及蛋白質(zhì)工程技術對編碼抗體的基因按不同需要進行改造和重組而制備的抗體，目前基因

2、工程抗體主要包括有嵌合抗體、人源化抗體、全人源抗體等。近年，抗體藥物向低抗原性、高特異性方向發(fā)展，利用體外篩選技術篩選全人源抗體成為抗體藥物主要發(fā)展趨勢。人胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素(thymic stromallymphopoietin，TSLP)是一種新型的、與白細胞介素-7（IL-7）類似的細胞因子，當過敏性炎癥發(fā)生時其在皮膚角質(zhì)形成細胞和氣道上皮細胞高度表達，能強烈刺激髓系樹突狀細胞(Den-driticcell，DC)介導的Th2

3、型炎癥反應發(fā)生。在全基因組相關研究中，發(fā)現(xiàn)TSLP基因是一種與易患過敏性疾病相關的位點之一[1]。在小鼠、靈長類動物實驗模型[2-4]中，已證實TSLP是誘導Th2型過敏性炎癥疾病的關鍵啟動因子。鑒于TSLP在過敏性疾病中發(fā)生的重要作用，本研究通過噬菌體展示技術從天然噬菌體抗體文庫中篩選抗TSLP全人源單鏈抗體，并對篩選的單鏈抗體進行特性分析，為過敏性炎癥疾病提供新的治療途徑。
　　方法:擴增TSLP cDNA，將目的基因與表達載

4、體pET101/D-TOPO連接，轉化大腸桿菌BL21，IPTG誘導表達并對表達產(chǎn)物進行純化鑒定。以生物素化TSLP蛋白為抗原利用噬菌體展示技術對前期構建的天然抗體文庫進行3輪富集，用ELISA檢測技術從富集的單鏈抗體文庫中篩選抗TSLP全人源單鏈抗體(scFv)。用BstNⅠ酶切方法對篩選抗TLSP-scFv陽性克隆子進行指紋圖譜分析;將指紋圖譜不同的克隆子連接LZ16載體，轉化大腸桿菌BL21后進行表達純化，用Dot blot及We

5、stern blot方法對表達純化的抗TLSP-scFv蛋白進行鑒定;用間接非競爭ELISA分析純化后抗TLSP-scFv抗體效價;用競爭ELISA方法檢測scFv和TSLP受體與TSLP的競爭結合，分析scFv與TLSP受體是否作用于TSLP的同一抗原表位，從而達到封阻TSLP與受體結合的功能;用大分子相互作用分析技術對抗TSLP全人單鏈抗體進行特異性及親和力分析。
　　結果:①.TSLP抗原的表達純化及鑒定:對TSLP基因的開

6、放閱讀框(ORF)進行了PCR擴增，擴增的TSLP cDNA片段大小為423 bp左右;將cDNA與pET101/D-TOPO連接，轉化BL21進行表達，表達的TSLP蛋白大小為26 KDa左右;Dot blot及Western blot鑒定顯示表達的蛋白正確，為TSLP目的蛋白。②.抗TSLP全人源單鏈抗體篩選與表達:以生物素化TSLP蛋白為抗原，采用噬菌體展示技術對全人源抗體文庫進行3輪富集，通過ELISA檢測有35％的scFv與T

7、SLP有結合特性;將與TSLP結合能力強的單鏈抗體基因與原核分泌性表達載體LZ16相連接，構建重組表達載體scFv-LZ16，對單鏈抗體進行表達及純化，結果顯示scFv在大腸桿菌DH5aF'中主要為分泌性表達，表達產(chǎn)物主要集中在細胞周質(zhì)間，為可溶性表達，抗體具備生物學活性。③.抗TSLP全人源單鏈抗體特性分析:SDS-PAGE電泳顯示純化后的單鏈抗體大小為27 KDa左右，Dot blot、Western blot及測序結果顯示表達純化

8、的單鏈抗體蛋白正確;非競爭ELISA實驗結果顯示表達的單鏈抗體可與抗原良好結合，對單鏈抗體進行倍比稀釋，隨著單鏈抗體蛋白濃度降低，與抗原結合能力隨之降低，單鏈抗體最低可以稀釋至100倍;大分子相互作用實驗(Blitz)結果顯示抗TSLP全人源單鏈抗體特異性好，與其他相關細胞因子沒有交叉反應，與相應抗原TSLP反應較好且得到親和力KD值為10-7，可見篩選得到抗TSLP全人源單鏈抗體有較高特異性和親和力;競爭ELISA結果顯示:TLSPR