發(fā)展及優(yōu)化高通量鈣熒光方法篩選TRPV3通道天然抑制劑及藥理學活性評價.pdf

1、分類號：R966R966密級：公開公開UDC：610610學校代碼：1106511065碩士學位論文發(fā)展及優(yōu)化高通量鈣熒光方法篩選TRPV3通道天然抑制劑及藥理學活性評價孫曉梅指導教師王克威（教授）學科專業(yè)名稱藥理學論文答辯日期2017年5月21日I發(fā)展及優(yōu)化高通量鈣熒光方法篩選發(fā)展及優(yōu)化高通量鈣熒光方法篩選TRPV3通道天然抑制劑通道天然抑制劑及藥理學活性評及藥理學活性評價摘要瞬時受體電位（TransientReceptPotenti

2、alTRP）通道家族成員TRPV3是一種鈣通透性、配體門控的非選擇性陽離子通道。TRPV3通道作為一種溫覺感受器，激活溫度范圍為33℃39℃，其主要分布于人體的背根神經節(jié)、三叉神經節(jié)和皮膚角化細胞等中樞神經和外周感覺系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)，TRPV3通道不僅與溫度感受相關，還與疼痛、瘙癢以及皮膚毛發(fā)生長等生理活動和病例有著密切的聯(lián)系。雖然TRPV3通道與眾多生理病理活動相關，但目前尚卻缺乏特異性作用于TRPV3通道的工具藥，使得TRPV3通道的

3、藥理學研究受到極大地限制。研究目的研究目的發(fā)展、優(yōu)化高通量篩選TRPV3通道調節(jié)劑的方法，尋找TRPV3通道的特異性抑制劑。研究方法研究方法采用FlexStation3儀器，通過優(yōu)化表達TRPV3通道的HEK293T細胞密度、Cal520鈣熒光染料的孵育時間和濃度、以及TRPV3的非特異性激動劑2APB樟腦與釕紅（TRPV3非選擇性抑制劑）的加藥先后順序等四個條件，對高通量鈣熒光篩選TRPV3離子通道調節(jié)劑的方法進行條件優(yōu)化；運用抑制劑

4、釕紅，評價2APB所致鈣熒光信號的增強是否來自直接通過激活TRPV3通道；通過應用優(yōu)化后的高通量篩選方法，篩選靶向TRPV3通道的天然調節(jié)劑；應用全細胞膜片鉗記錄進行活性確認及選擇性評價；對天麻干燥的塊莖運用減壓加熱回流、HPD100大孔吸附樹脂、ODS柱、硅膠柱、HPLC高效液相色譜儀，結合正向、反向薄層色譜對天麻有效成分進行提取分離；采用優(yōu)化的高通量篩選方法對天麻提取物進行靶向TRP通道的活性測定與評價。研究結果研究結果本研究成功建

5、立并優(yōu)化了高通量鈣熒光篩選TRPV3離子通道調節(jié)劑的方法，得到的最佳篩選條件為細胞密度40000個細胞孔、Cal520鈣熒光染料濃度為5.0%、孵育時間為1.5h、篩選TRPV3通道調節(jié)劑時應先加入抑制劑再加入待測化合物進行測試；運用優(yōu)化的高通量鈣熒光方法，測得釕紅抑制TRPV3通道的半抑制濃度（IC50）為5.351.39?M，并從天然產物中發(fā)現(xiàn)了新的TRPV3通道抑制劑—甲基蓮心堿。全細胞膜片鉗記錄實驗測定甲基蓮心堿抑制TRPV3通