水稻條紋病毒編碼的SP蛋白功能及其與寄主因子PsbP的互作研究.pdf

1、由水稻條紋病毒（Rice stripe virus，RSV）引起的水稻條紋葉枯病是目前我國水稻生產上最具威脅性的病毒病之一。近年來該病在我國不同省市水稻產區(qū)多次爆發(fā)，甚至流行成災，使水稻生產受到嚴重影響，造成巨大的經濟損失。RSV基因組RNA4的病毒鏈編碼一個病害特異蛋白(disease-specific protein，SP)。過去研究發(fā)現(xiàn)SP蛋白在病葉中的積累量與褪綠花葉癥狀的嚴重程度成正相關，推測該蛋白是致病相關蛋白，但SP蛋白的

2、具體功能至今還沒有相關報道。為了弄清SP蛋白在RSV侵染及致病中的作用，本論文對SP蛋白的功能及其與寄主因子的互作機理進行了研究。
　　 利用馬鈴薯X病毒(Potato virus X)異源病毒載體表達SP基因并侵染本氏煙，與PVX空載體侵染的植株相比，SP蛋白的表達能夠顯著加重癥狀。根據在線蛋白結構預測網站（http://www.predictprotein.org）的分析結果，對SP基因進行無義突變和缺失突變，并將各突變體構

3、建到PVX載體上浸潤本氏煙。結果發(fā)現(xiàn)當SP缺失了C端52個氨基酸(muSP4)時，致病能力顯著減弱，癥狀接近于PVX空載體侵染的植株。利用轉基因技術將SP基因分別整合入本氏煙和水稻的基因組中，并將muSP4基因也整合入本氏煙基因組中，Northern和Western印跡分析表明SP及muSP4基因能夠在這些轉基因植株中正常轉錄翻譯，但植株沒有任何異常表型。進一步在轉基因植株上接種RSV病毒，與轉空載體植株相比，轉SP基因植株發(fā)病明顯提前

4、，癥狀加重，并且Northern blot檢測到病毒積累量也顯著增多，而RSV在轉muSP4基因植株和在轉空載體植株上的侵染效率無明顯差異。表明SP蛋白的表達提高了病毒的侵染效率，且SP的C端結構域起關鍵作用。
　　 以RSV SP蛋白為誘餌，利用酵母雙雜交系統(tǒng)從水稻cDNA文庫中篩選與SP蛋白互作的水稻寄主因子。通過營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基和ABA抗生素篩選，并進一步通過回轉驗證，最終確定了OsPsbP蛋白是與SP互作的水稻寄主因子之

5、一。序列比對分析發(fā)現(xiàn)水稻、普通煙、大麥、竹子編碼的PsbP基因具有很高的氨基酸同源性?？寺”臼蠠熤械腜sbP全長cDNA（NbPsbP）構建到pGADT7載體上，并將SP各個突變體基因構建到pGBKT7載體上，經酵母雙雜交實驗驗證發(fā)現(xiàn)SP與NbPsbP蛋白也能互作，而muSP4不能與兩種PsbP蛋白互作。通過雙分子熒光互補試驗證實SP和PsbP蛋白能夠在煙草表皮細胞中互作，并且互作主要發(fā)生在細胞質和細胞核中，而muSP4在植物體內同樣不

6、能與PsbP蛋白互作。將SP和PsbP兩個蛋白體外表達純化，通過GST pull-down實驗進一步證實兩個蛋白在體外也能互作。
　　 為了進一步了解RSV SP與PsbP的互作機理，利用轉基因和RNAi技術獲得PsbP過表達和表達下調的水稻和本氏煙植株，通過real-time RT-PCR、Northernblot和Western blot實驗證實PsbP確實顯著上調或者下調。觀察發(fā)現(xiàn)PsbP表達下調的植株葉片輕微發(fā)白，生長遲

7、緩，而過表達植株表型正常。通過光合作用相關參數測定實驗發(fā)現(xiàn)PsbP表達下調的本氏煙與轉SP基因本氏煙葉片中的凈光合速率、電子傳遞效率和最大光化學效率均顯著下降，說明在這些植株中光合作用受到抑制。
　　 常溫包埋葉片并電鏡觀察發(fā)現(xiàn)PsbP表達下調后細胞中的葉綠體結構紊亂，片層結構疏松瀕臨瓦解，而在轉SP基因和感染RSV的植株細胞中也出現(xiàn)了類似的現(xiàn)象。在煙草細胞中對PsbP蛋白進行亞細胞定位，將PsbP與GFP的融合表達載體在本氏煙

8、葉片中進行瞬時表達，36小時后提取原生質體，激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)PsbP融合蛋白在野生型本氏煙中僅定位于葉綠體，而在轉SP基因的本氏煙中除了定位于葉綠體，還定位于細胞質，說明SP蛋白的存在能夠改變PsbP的亞細胞定位。進一步通過免疫膠體金標記實驗檢測PsbP蛋白在各種處理的植株葉綠體中的積累量和定位情況，發(fā)現(xiàn)在PsbP表達下調的植株細胞中PsbP蛋白僅定位于葉綠體中，但是積累量是野生型本氏煙的25％左右，而在感染RSV和轉SP基因的

9、植株細胞中PsbP蛋白定位于葉綠體、細胞質和線粒體中，并且在葉綠體中的積累量顯著下降到對照的35-60％。在轉muSP4基因的本氏煙中PsbP蛋白的定位和積累量與對照沒有顯著差異。這些結果表明，SP能夠通過與PsbP的互作改變PsbP蛋白的定位，并減少其在葉綠體中的積累量。
　　 為了了解RSV SP與PsbP互作的生物學意義，我們利用DNA1和BMV載體分別沉默本氏煙和水稻中的PsbP基因，將real-time RT-PCR證

10、實PsbP基因表達顯著下調的植株與PsbP過表達和表達下調的轉基因植株一起進行病毒侵染效率測定實驗。結果發(fā)現(xiàn)，與野生型本氏煙相比，RSV侵染效率在過表達PsbP的植株中明顯下降，植株發(fā)病略微推遲，癥狀較輕，且Northern印跡檢測到的病毒積累量較少;而在PsbP表達下調的植株中則剛好相反，RSV侵染效率顯著提高，植株發(fā)病提前，癥狀加重，檢測到的病毒積累量明顯高于對照。表明PsbP蛋白的積累量會影響病毒的侵染效率。
　　 上述結