姜黃素抑制單核細胞來源的巨噬細胞肝臟浸潤抗小鼠肝纖維化作用.pdf

1、目的:
　　本研究首先收集不同病因?qū)е碌腃LD患者肝組織標本，采用免疫組織化學的方法對不同病因?qū)е碌腃LD患者肝組織中單核細胞來源的巨噬細胞及MCP-1水平進行分析，以明確單核細胞來源的巨噬細胞及MCP-1表達與CLD患者肝纖維化的關系。進一步通過建立CCl4誘導的小鼠肝損傷和肝纖維化模型，驗證單核細胞來源的巨噬細胞及MCP-1在肝損傷和纖維化中的作用，并觀察姜黃素抗肝損傷和纖維化的作用，探討姜黃素抑制MCP-1減輕單核細胞來源的

2、巨噬細胞肝臟浸潤抗肝損傷和纖維化的作用機理，為姜黃素的應用提供理論依據(jù)，同時為肝纖維化的治療提供新的思路。
　　方法:
　　第一部分 慢性肝病患者肝組織內(nèi)單核細胞來源的巨噬細胞浸潤研究
　　收集93例CLD患者，包括慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者65例，原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)患者7例，自身免疫性肝炎(autoimmune he

3、patitis，AIH)患者14例，酒精性肝病(alcoholic liverdisease，ALD)患者7例及23例正常供肝組織石蠟標本，采用免疫組織化學方法檢測CLD患者及正常對照肝組織中CD68+巨噬細胞和MAC387+單核細胞來源的巨噬細胞浸潤情況及MCP-1表達。比較不同病因的CLD患者與正常對照組肝組織CD68+巨噬細胞和MAC387+單核細胞來源的巨噬細胞及MCP-1表達情況的差異及其與炎癥分級和纖維化分期的關系。

4、　　第二部分 姜黃素抑制單核細胞來源的巨噬細胞肝臟浸潤抗小鼠急性肝損傷和肝纖維化作用
　　1.姜黃素抑制單核細胞來源的巨噬細胞肝臟浸潤抗小鼠急性肝損傷作用:
　　C57BL/6小鼠單次腹腔注射CCl4建立急性肝損傷模型并給予姜黃素灌胃干預，檢測各組小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine amiotransferase，ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)水平;進行小鼠肝組織HE染色

5、，評價姜黃素的抗急性肝損傷作用;流式細胞術檢測小鼠肝組織內(nèi)T細胞、樹突狀細胞(dendritic cells，DC)、自然殺傷(natural killer，NK)細胞及NKT細胞、單核細胞來源的巨噬細胞及其亞群比例。并采用抗CD45抗體、抗F4/80抗體、抗CD11b抗體進行免疫組織化學分析，檢測各組小鼠肝組織內(nèi)CD45+白細胞、F4/80+巨噬細胞、CD11b+單核細胞浸潤情況。Real time PCR檢測小鼠肝組織內(nèi)炎癥因子TN

6、F-α、IL-6、IL-1β mRNA表達。Real time PCR及免疫組織化學法檢測小鼠肝組織MCP-1的表達。
　　2.姜黃素抑制單核細胞來源的巨噬細胞肝臟浸潤抗小鼠肝纖維化作用:
　　C57BL/6小鼠反復腹腔注射CCl4，連續(xù)6周，建立肝纖維化模型，姜黃素灌胃給藥，檢測各組小鼠血清ALT和AST水平;小鼠肝組織HE染色、Masson染色，評價姜黃素的抗肝纖維化作用。流式細胞術檢測小鼠肝組織中T細胞、DC細胞、NK

7、細胞及NKT細胞、單核細胞來源的巨噬細胞及其亞群比例。并采用免疫組織化學方法檢測各組小鼠肝組織內(nèi)CD45+白細胞、F4/80+巨噬細胞、CD11b+單核細胞浸潤情況。Real time PCR檢測小鼠肝組織內(nèi)TNF-α、IL-6、IL-1β、TGF-β1 mRNA表達。Real time PCR及免疫組織化學法檢測小鼠肝組織MCP-1的表達。免疫組織化學檢測小鼠肝組織內(nèi)α-SMA表達，探討姜黃素對HSC活化的影響。
　　結果:

8、r>　　第一部分 慢性肝病患者肝組織內(nèi)單核細胞來源的巨噬細胞浸潤研究
　　1.CHB、PBC、AIH及ALD患者肝組織內(nèi)CD68+巨噬細胞均較正常對照肝組織明顯增多。CLD患者肝組織內(nèi)CD68+巨噬細胞數(shù)量與CLD患者ALT、AST、GGT、Tbil水平及Child-Pugh評分均呈明顯的正相關，與Alb等水平無明顯的相關性。
　　2.CHB、PBC、AIH及ALD患者肝組織內(nèi)MAC387+單核細胞來源的巨噬細胞均較正常對照

9、肝組織明顯增多，而不同病因CLD患者肝組織內(nèi)MAC387+單核細胞來源的巨噬細胞無明顯統(tǒng)計學差異。CLD患者肝組織內(nèi)MAC387+單核細胞來源的巨噬細胞數(shù)量與CLD患者ALT、AST、GGT、Tbil水平及Child-Pugh評分均無明顯的相關性，而與Alb呈負相關，與CRP水平呈正相關。
　　3.正常對照肝組織，僅有很少量MCP-1表達，而CLD患者肝組織內(nèi)可見大量MCP-1表達。不同纖維化分期的CLD患者，肝組織內(nèi)MCP-1評

10、分均較正常對照組明顯增高，而S4期患者MCP-1評分又明顯高于S0-1、S2及S3期CLD患者。相關性分析發(fā)現(xiàn)MCP-1表達與CD68+巨噬細胞及MAC387+單核細胞來源的巨噬細胞數(shù)量均呈明顯的正相關。
　　第二部分姜黃素抑制單核細胞來源的巨噬細胞肝臟浸潤抗小鼠急性肝損傷和肝纖維化作用
　　1.姜黃素抑制單核細胞來源的巨噬細胞肝臟浸潤抗小鼠急性肝損傷作用:CCl4單次注射可以顯著造成小鼠急性肝損傷，表現(xiàn)為CCl4注射48

11、h后小鼠血清ALT、AST水平較正常組明顯增高;肝組織HE染色示，CCl4注射后小鼠肝組織肝細胞大量壞死，并伴有炎癥細胞浸潤。姜黃素治療并不能顯著減低小鼠血清ALT、AST水平，但可以明顯減輕小鼠肝細胞損傷和炎癥細胞浸潤。CCl4單次腹腔注射后，小鼠肝組織單核細胞來源的巨噬細胞比例較正常對照組明顯增加，而增加的單核細胞來源的巨噬細胞主要為Gr1hi單核細胞來源的巨噬細胞。而其他細胞如T細胞、DC細胞、NK細胞及NKT細胞變化不明顯。姜黃

12、素能夠明顯抑制單核細胞來源的巨噬細胞的浸潤，能抑制Gr1hi單核細胞來源的巨噬細胞。免疫組化分析示模型組肝組織內(nèi)CD45+白細胞、F4/80+巨噬細胞、CD11b+單核細胞較正常對照組明顯增加，而姜黃素組可以明顯減少這些細胞的浸潤。CCl4注射48 h后小鼠肝組織炎癥因子TF-α、IL-6較正常對照組明顯增高，IL-1β亦有增高的趨勢。姜黃素組小鼠肝組織內(nèi)TNF-α、IL-6、IL-1β較模型組并無明顯降低。Real time PCR檢

13、測各組小鼠肝組織MCP-1的mRNA表達水平，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠肝組織內(nèi)MCP-1表達水平較正常對照組明顯升高。而姜黃素組小鼠肝組織內(nèi)MCP-1 mRNA水平亦明顯高于正常對照組，但較模型組無明顯降低。進一步對小鼠肝組織采用MCP-1抗體進行免疫組化分析，結果發(fā)現(xiàn)模型組肝組織內(nèi)MCP-1表達明顯較正常對照組增強，而姜黃素組小鼠肝組織MCP-1染色明顯弱于模型組。
　　2.姜黃素抑制單核細胞來源的巨噬細胞肝臟浸潤抗小鼠肝纖維化作用:

14、r>　　CCl4反復注射可以顯著造成小鼠肝纖維化，表現(xiàn)為小鼠血清ALT、AST水平較正常組明顯增高;肝組織HE染色示，肝細胞大量壞死，小葉結構紊亂，并伴有炎癥細胞浸潤;Masson染色示小鼠肝組織內(nèi)膠原纖維較正常對照組明顯增多，肝小葉纖維間隔形成。姜黃素治療能顯著減低小鼠血清ALT、AST水平，明顯減輕小鼠肝細胞損傷和炎癥細胞浸潤，減輕肝組織纖維增生。CCl4反復腹腔注射后，模型組小鼠肝組織單核細胞來源的巨噬細胞比例較正常對照組明顯增加

15、，而增加的單核細胞來源的巨噬細胞主要為Gr1hi單核細胞來源的巨噬細胞。模型組CD3+T細胞比例及DC細胞比例明顯高于正常對照組，而NK及NKT細胞比例明顯低于正常對照組。而姜黃素對T細胞、DC細胞、NK細胞及NKT細胞無明顯影響。但姜黃素能夠明顯抑制單核細胞來源的巨噬細胞的浸潤，主要以抑制Gr1hi單核細胞來源的巨噬細胞亞群為主。免疫組化分析示模型組小鼠肝組織內(nèi)CD45+白細胞、F4/80+巨噬細胞、CD11b+單核細胞較正常對照組明

16、顯增加，而姜黃素可以明顯減少這些細胞的浸潤。CCl4注射6周后模型組小鼠TNF-α水平較正常對照組明顯增高，IL-1β、IL-6 mRNA水平亦呈增高趨勢，而姜黃素能明顯降低肝組織內(nèi)促炎因子TNF-α mRNA表達。模型組小鼠肝組織內(nèi)TGF-β1mRNA水平較正常對照組明顯增高，而姜黃素干預后小鼠肝組織內(nèi)TGF-β1mRNA水平較模型組明顯降低。Real time PCR及免疫組織化學檢測各組小鼠肝組織MCP-1的表達水平，結果提示模型

17、組小鼠肝組織內(nèi)MCP-1表達水平較正常對照組明顯升高。而姜黃素能明顯降低小鼠肝組織內(nèi)MCP-1表達水平。小鼠肝組織MCP-1免疫組化也有同樣發(fā)現(xiàn)。此外，α-SMA免疫組化還表明，姜黃素能明顯抑制α-SMA表達，提示其能抑制HSC的活化。
　　結論:
　　1.不同病因的CLD患者肝組織內(nèi)巨噬細胞及單核細胞來源的巨噬細胞明顯增多且與肝臟的炎癥程度和纖維化程度相關;MCP-1可能介導了CLD患者肝組織內(nèi)的單核細胞浸潤;