人CD48基因轉(zhuǎn)染細胞株的構(gòu)建及其單克隆抗體的研制.pdf

1、CD48是分子量為40-45kD的GPI錨定糖蛋白，與CD2、CD58、CD244(284)、Ly9和SLAM均屬于CD2家族成員。CD48廣泛表達于T細胞、B細胞、NK細胞、樹突狀細胞、單核細胞、中性粒細胞、肥大細胞、嗜酸性細胞等一系列免疫細胞、內(nèi)皮細胞以及腫瘤細胞表面，在腫瘤患者血漿中發(fā)現(xiàn)可溶性CD48增加。CD48分子參與維持NK細胞平衡和功能效應(yīng)、在T細胞活化早期產(chǎn)生IL-2并維持T細胞進一步活化過程中起到關(guān)鍵作用，在針對病毒感

2、染治療中，CD48/CD244是獨立于PD-1通路的新型干預(yù)靶點。通過CD48、CD244和CD150分子的聯(lián)合分析可對小鼠HSC的原始性予以精確界定。因此CD48是參與免疫細胞的發(fā)育、機體免疫應(yīng)答和免疫調(diào)控的重要分子，在腫瘤免疫和自身免疫過程中起著極為重要的作用，CD48及其信號途徑是腫瘤免疫和自身免疫調(diào)控的重要靶點。本研究克隆了人CD48基因讀碼框(ORF)全長序列、構(gòu)建了逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體、建立了穩(wěn)定表達人CD48分子的基因轉(zhuǎn)染細

3、胞株，并研制了鼠抗人CD48單克隆抗體，為進一步探討CD48分子的作用機理和靶向CD48分子的免疫干預(yù)奠定了基礎(chǔ)。本研究分為兩個部分：
　　 第一部分：人CD48基因轉(zhuǎn)染細胞株的建立。
　　 目的：建立穩(wěn)定表達人CD48分子的基因轉(zhuǎn)染細胞株。
　　 方法：提取健康人外周血單個核細胞總RNA，通過RT-PCR克隆CD48基因的ORF全長序列，重組入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pEGZ/term，將重組載體命名為pEGZ/CD48

4、。將pEGZ/CD48及其輔助病毒載體pHIT456和pHIT60混合后，采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染包裝細胞：293T細胞，獲得具有感染能力的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的培養(yǎng)上清，而后感染L929細胞，通過Zeocine加壓篩選、流式細胞術(shù)檢測和RT-PCR驗證，獲得穩(wěn)定表達CD48分子的基因轉(zhuǎn)染細胞株。
　　 結(jié)果：⑴成功構(gòu)建重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體pEGZ/CD48經(jīng)RT-PCR擴增獲得CD48基因ORF全長片段；經(jīng)酶切鑒定和雙向DNA測序表明：獲

5、得正確的人CD48基因并成功地重組入pEGZ-term表達載體，命名為pEGZ/CD48。⑵成功建立穩(wěn)定表達人CD48分子的基因轉(zhuǎn)染細胞株L/CD48。重組質(zhì)粒pEGZ/CD48、pHIT60和pHIT456在采用脂質(zhì)體法導(dǎo)入293T細胞48h后，通過熒光顯微鏡可觀察到293T細胞表達綠熒光蛋白(GFP)，收集培養(yǎng)上清感染L929細胞，兩周后獲得Zeocine抗性的L929細胞克隆。熒光顯微鏡下可見Zeocine抗性L929細胞表達綠熒

6、光蛋白。Zeocine抗性L929細胞經(jīng)免疫熒光標記和流式細胞儀檢測并經(jīng)RT-PCR證實表達CD48分子，命名為L/CD48。
　　 結(jié)論：在獲得正確人CD48基因基礎(chǔ)上，成功構(gòu)建重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體pEGZ/CD48和穩(wěn)定表達人CD48分子的基因轉(zhuǎn)染細胞株。
　　 第二部分：鼠抗人CD48單克隆抗體的研制及其生物學(xué)特性的研究。
　　 目的：為探討CD48分子生物學(xué)功能及其作用機理，并為靶向CD48分子的應(yīng)用提

7、供研究工具。
　　 方法：以單核細胞性白血病細胞株THP-1多次免疫Balb/c小鼠，采用B淋巴瘤雜交瘤技術(shù)將免疫后小鼠脾臟細胞和小鼠骨髓瘤細胞株SP2/0融合，采用L/CD48基因轉(zhuǎn)染細胞株為抗原篩選獲得分泌特異性識別人CD48分子的單抗的雜交瘤細胞株3H6，采用試紙法鑒定單抗3H6的類型，流式細胞術(shù)分析單抗3H6的識別譜，競爭法分析單抗3H6的識別位點，腹水法生產(chǎn)以及親和層析分離純化單抗3H6，將不同劑量的單抗3H6加入CD

8、48+白血病細胞株Raji和THP-1培養(yǎng)體系中，觀察細胞生長狀態(tài)并采用細胞計數(shù)法分析細胞增殖情況。
　　 結(jié)果：成功地建立了穩(wěn)定分泌抗人CD48單克隆抗體的雜交瘤細胞株3H6，單抗3H6重鏈為IgG1、輕鏈為κ鏈，與商品化抗人CD48單抗MEM-102識別譜一致，通過位點競爭實驗表明單抗3H6與MEM-102識別位點不同，進而發(fā)現(xiàn)，單抗3H6在體外可促進CD48+細胞株THP-1和Raji細胞聚團并抑制其增殖。