神經(jīng)營養(yǎng)素低親和力受體p75NTR信號傳導及誘導細胞凋亡的相關基因的功能研究.pdf

1、首先,我們對p75NTR介導的信號通路進行了研究,通過酵母雙雜交系統(tǒng)檢測與p75NTR有相互作用的蛋白.該方法理論基礎為:含有異源BD(DNA binding domain)和AD(transcriptional activation domain)的融合蛋白可以借助BD和AD的結合形成完整的反式作用因子,激活下游報告基因的轉錄.結果如下:1,通過PCR擴增出完整的p75NTR胞內(nèi)區(qū)的cDNA片段p75ICD,克隆至BD表達載體pAS2

2、-1,與表達AD的鼠腦cDNApACT2文庫質粒共轉化酵母Y190細胞,通過三營養(yǎng)缺陷(-Trp-Leu-His)、雙報告基因表達(His,LacZ)的雙重篩選及假陽性的排除,得到多個陽性克隆.2,對這些陽性克隆的測序及同源性分析顯示,一個長約2.7kb的cDNA片段與RanBPM高度同源,并有著相同的讀碼框架.3,在哺乳動物細胞COS7中共轉染p75ICD和RanBPM的真核表達載體,經(jīng)免疫共沉淀和蛋白印記雜交檢測到這兩個蛋白的表達,

3、并驗證了它們在細胞內(nèi)的結合.4,通過PCR擴增出p75NTR胞內(nèi)區(qū)的兩個已知功能結構域的cDNA片段p75dd、p75jux,分別構建其酵母表達載體,通過檢測His報告基因的表達,確認RanBPM與p75ICD的結合位點位于死亡結構域.5,通過PCR擴增出RanBPM蛋白中的SPRY結構域cDNA片段,克隆至Pact2載體得到pACT2-SPRY,通過His報告基因的表達,確認:單獨的SPRY結構域并不能與p75ICD結合.其次,我們對

4、凋亡相關的蛋白ARBP進行了克隆和功能研究.我們實驗室在R2細胞系中轉染并表達了神經(jīng)營養(yǎng)低親和力受體-命名為R2L1細胞.R2L1細胞表達有神經(jīng)營養(yǎng)高親和力受體-TrkA、TrkB,去血清培養(yǎng)后會導致細胞凋亡,凋亡時間隨培養(yǎng)條件不同而有所改變.通過DDRT-PCR技術,發(fā)現(xiàn)片段LIAREST-1在正常培養(yǎng)和去血清培養(yǎng)的R2L1細胞中都有表達,但在去血清培養(yǎng)的細胞中表達量顯著上升.基于以上結果,我們進行了如下的深入研究:1,應用cDNA末

5、斷快速擴增(RACE)的原理,用基因特異性引物GSP和通用引物AP1聯(lián)合進行PCR擴增,篩選大鼠腦cDNA,得到新的延長序列,共901bp,GenBank收錄號為AF304429.2,通過分析發(fā)現(xiàn),該全長序列含有一個編碼109個氨基酸殘基的開放讀碼框架,該蛋白分子量為12.5kD,等電點為10.4,因此將此蛋白命名為凋亡相關的堿性蛋白(Apoptosis Related Basic Protein,ARBP).3,免疫組化結果表明,AR

6、BP蛋白在大鼠體內(nèi)有廣泛的分布.4,通過DNA重組技術建立了ARBP的正義和反義的真核表達載體,轉染R2L1細胞后發(fā)現(xiàn),轉染了反義表達載體的R2L1細胞表現(xiàn)為增殖加快,同時,去血清誘導的細胞凋亡受到抑制.5,構建pAS2-1arbp重組質粒,與pACT2文庫質粒共轉化酵母Y190細胞,篩選小鼠腦cDNA文庫得到一些cDNA片段,其中一個長1.5kb的片段與突觸相關蛋白SNAP-25的結合蛋白-Snapin的cDNA序列高度同源,393b