雞腺胃炎病原的分離及Real-time PCR檢測IBV在各器官的表達.pdf

1、2011-2012年肉雞和蛋雞腺胃炎發(fā)病率較高，該病在中國大部分省份均有發(fā)生和流行，給養(yǎng)雞業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。加強對該病檢測方法的研究，對控制傳染性病毒性腺胃炎病的發(fā)生，保護和促進養(yǎng)雞業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。自腺胃炎發(fā)生以來，關于腺胃炎的病因仍然眾說紛紜，本研究在臨床上遇到的傳染性病毒性腺胃炎病例中分離出了傳染性支氣管炎病毒(IBV)。不同發(fā)病程度的患病雞的剖檢變化不同，對于病因不詳?shù)牟《拘约膊?，弄清楚病毒侵害的主要靶器官對于該?/p>

2、的預防和治療起著至關重要的作用。因此筆者應用實時熒光定量PCR的方法對患病雞的胸腺、肺臟、心臟、腺胃、腎臟、肝臟、腦等器官中病毒的含量做定量分析并進行差異顯著性分析。
　　 將連續(xù)盲傳八代的尿囊液進行直接血凝試驗，病毒無血凝性，用1％磷脂酶C處理后有血凝性。也通過對NDV的干擾實驗及RTPCR實驗初步鑒定該病毒為傳染性支氣管炎病毒。首先針對IBV-N基因序列設計了一對特異性引物，進行RT-PCR反應，擴增出216bp的目的片段，

3、同時參照已往發(fā)表的文獻合成一對擴增內(nèi)參基因的-β-actin引物，大小為139bp。將這兩個擴增的目的片段分別與pEASY-T1 Cloning Vector重組，將重組質粒分別命名為pEASY-T1-N和pEASY-T1-β-actin。將兩個重組質粒酶切鑒定、測序成功后作為標準品，進行熒光定量PCR標準曲線的建立。實驗結果顯示:標準曲線線性關-系R2值為0.9972和0.9983，相關性極好，檢測極限為1.0 E+02拷貝。

4、　　 對腺胃炎病例各器官進行RNA的提取，以cDNA為模板進行熒光定量PCR，將測得的Ct值代入標準曲線公式計算出N基因和β-actin基因的拷貝數(shù)，然后根據(jù)公式:IBV-N相對表達量=IBV-N拷貝數(shù)/β-actin拷貝數(shù)計算IBV-N的相對含量。用已建立的方法對臨床樣品檢測，結果顯示腺胃中病毒的相對含量最高;腎臟次之，與肺臟差異不顯著，與其他器官差異顯著，肺臟居第三，與肝臟、腎臟差異不顯著，與其他器官具有顯著性差異。肝臟居第四，與