Bruton酪氨酸激酶對(duì)高氧誘導(dǎo)小鼠肺損傷作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　1.建立小鼠高氧肺損傷模型，了解Btk在高氧肺損傷中的表達(dá)及活化情況，以期探索肺損傷嚴(yán)重程度與Btk的關(guān)系；
　　2.探討B(tài)tk與Nf-kβ信號(hào)通路在高氧誘導(dǎo)小鼠肺部炎癥反應(yīng)中的相互作用，以及在細(xì)胞凋亡中的調(diào)控角色，進(jìn)一步探索Btk在高氧損傷發(fā)病過(guò)程中所參與的分子機(jī)制；
　　3.進(jìn)一步研究Btk與炎癥細(xì)胞因子的關(guān)系，探索該信號(hào)通路的上下游的調(diào)控方向，以及了解氧化應(yīng)激下的病理機(jī)制作用。
　　方法：

2、>　　第一部分：Btk在不同時(shí)間段高氧肺損傷表達(dá)變化的研究
　　選取健康昆明小鼠60只，隨機(jī)分為對(duì)照組和高氧暴露組(H組），其中高氧暴露組分別按1、2、3、7天時(shí)間點(diǎn)分四個(gè)亞組，每組12只。對(duì)照組給予常規(guī)呼吸室內(nèi)空氣；高氧暴露組動(dòng)物置于自制氧氣艙，維持氧濃度在95％以上。造模完成后通過(guò)肉眼觀(guān)察肺組織外觀(guān)，HE染色鏡下觀(guān)察肺組織病理學(xué)改變，測(cè)定肺組織W/D比值和BALF中TP含量綜合評(píng)估各組小鼠肺組織損傷程度，并通過(guò)Western

3、blot半定量法測(cè)定各時(shí)間段小鼠肺組織中Btk、p-Btk的表達(dá)水平。
　　第二部分：Btk與NF-кB在高氧肺損傷分子機(jī)制中的作用研究
　　在第一部分實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為四組：對(duì)照組、高氧暴露3天組（H3d組）、抑制劑組和高氧暴露3天+抑制劑組（H3d+I組)。對(duì)照組的小鼠呼吸正?？諝?；H3d組置于氧氣艙內(nèi)吸入高濃度氧，氧濃度維持在95%左右；抑制劑組給予腹腔注射Btk特異性抑制劑LFM-A13（50mg/kg），每

4、12h重復(fù)給藥一次；H3d+I組同時(shí)給予上述兩種干預(yù)措施。造模完成后通過(guò)測(cè)定各組W/D比值、BALF中TP值和HE染色評(píng)估各組模型肺損傷嚴(yán)重程度，通過(guò)Western blot半定量各組小鼠肺組織中Btk、p-Btk、p-NF-кBp65和14-3-3蛋白的表達(dá)水平。采用RT-qPCR相對(duì)定量TNF-a、IL-6的mRNA水平，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清中MCP-1的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　第一部分：通過(guò)肉眼和鏡下形態(tài)學(xué)觀(guān)察

5、、肺組織W/D比值和BALF中TP含量測(cè)定結(jié)果顯示，H7d組肺組織損傷最為顯著。Western blot法測(cè)定結(jié)果顯示，各組小鼠肺組織中Btk、p-Btk的表達(dá)量隨高氧暴露時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增高，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均p<0.05）；H7d組與H3d組之間比較，肺組織Btk、p-Btk表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。
　　第二部分：采用Western blot、RT-qPCR及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，H3d+I組肺組

6、織W/D比值、BALF中TP含量和病理?yè)p傷評(píng)分明顯低于H3d組（p<0.05）；H3d組肺組織中Btk、p-Btk和p-NF-кBp65表達(dá)量均明顯高于H3d+I組、對(duì)照組和抑制劑組（均p<0.05）；H3d組肺組織14-3-3蛋白表達(dá)量均明顯低于H3d+I組、對(duì)照組和抑制劑組（均p<0.05）；而TNF-a和L-6的表達(dá)量均明顯高于H3d+I組、對(duì)照組和抑制劑組（均p<0.05）；H3d+I組血清中MCP-1含量雖高于對(duì)照組，但明顯低

7、于H3d組（p<0.05）。
　　結(jié)論：
　　第一部分：隨著高氧暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，肺組織病理?yè)p傷程度逐漸加重，同時(shí)肺組織Btk及p-Btk表達(dá)量逐漸增高，其表達(dá)量在高氧暴露3天左右達(dá)到峰值，提示Btk在高氧所致肺損傷發(fā)病初期具有一定作用。
　　第二部分：通過(guò)抑制肺組織Btk表達(dá)量可有效減輕肺損傷的嚴(yán)重程度，這種效應(yīng)可能與上調(diào)肺組織14-3-3蛋白表達(dá)，下調(diào)NF-кB和多種炎癥因子表達(dá)和活化有關(guān)。推測(cè)，Btk在氧化應(yīng)激狀態(tài)