SAM-IV核糖開關的結構與功能研究.pdf

1、核酸開關（Riboswitch）是一類天然存在的RNA傳感元件和基因調控因子，其通常與體內一系列小分子代謝物互作，隨即促發(fā)mRNA非編碼區(qū)（5'端）應答性變構而調控基因表達過程。多數(shù)學者認為，核酸開關介導的基因表達調控是一種古老的分子調控模式，無需蛋白質協(xié)助。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)的核酸開關主要來源于低等生物群落，尚未在人類體內發(fā)現(xiàn)類似的功能結構單元。
　　目前，S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine, SAM）核糖

2、開關家族的研究最為廣泛。SAM核糖開關是迄今發(fā)現(xiàn)的最大核糖開關家族，因其結合同一配體“SAM”而得名，它包含SAM-Ⅰ～SAM-Ⅴ五種亞型， S-box（SAM-Ⅰ）、SMK（SAM-Ⅲ）兩個亞型的研究較為深入，而SAM-Ⅳ、SAM-Ⅴ結構與功能信息卻知之甚少。SAM核糖開關各亞型結構和來源各異，甚至調控機理也不盡相同。廣泛的生化、結構和遺傳學研究已建立了核糖開關在生命體內發(fā)揮功能的基本原理，這對開發(fā)抗生素、設計新型分子傳感器、以及將核

3、糖開關整合進合成回路具有重要的指導意義。
　　本課題主要集中在SAM-Ⅳ的結構和功能研究上。首先，利用核酸結晶測試技術獲取SAM-Ⅳ與相應調控分子互作的三維結構信息，本階段主要完成多種SAM-Ⅳ RNA結晶體制備，為后續(xù)結晶測試奠定基礎。本研究工作是基于“天藍色鏈霉菌”（Streptomyces coelicolor,Sc），“金黃節(jié)桿菌”（Arthrobacter aurescens,Aau），“節(jié)桿菌”（Arthrobacte

4、r sp.，Asp）等野生型菌株的SAM-Ⅳ基因結構進行優(yōu)化設計，通過構建體外高效轉錄系統(tǒng)，經(jīng)誘導轉錄獲取轉錄本（SAM-Ⅳ RNA），再經(jīng)分離純化和回收獲取高純度樣品，以備結晶測試之用。其次，基于SAM-Ⅳ RNA進行SHAPE分析。SHAPE分析結果顯示，SAM的存在使SAM-Ⅳ的RNA二級，三級結構及預測的結合核心結構更加穩(wěn)定，同時SAM的結合依賴于P5部分的參與。推測其存在SAM依賴性分子調控機制，從而為SAM-Ⅳ核酸開關調控機

5、理研究奠定了基礎。整體工作分為三部分，具體如下：
　　1. SAMⅣ RNA制備與結晶
　　首先，基于野生型SAM-Ⅳ RNA序列信息進行模板優(yōu)化設計，其主要原則：1）保留核心功能區(qū)，剔除部分非功能區(qū)，并將部分非致死位堿基A，U突變?yōu)榉€(wěn)定性更高的堿基G，C；2）在構型兩側插入丁型肝炎病毒核酸酶（HDV ribozyme）及錘頭狀核酶（Hammerhead ribozyme）序列，以便于獲取準確的目的片段。
　　隨后，由

6、上海生工合成部代理合成優(yōu)化模板序列，構建重組質粒。再經(jīng)PCR擴增技術獲取大量SAM-Ⅳ優(yōu)化模板，進而利用構建好的體外轉錄體系經(jīng)高效轉錄獲取足量RNA，在轉錄體系中由于核酶的自剪切作用，將目的序列準確切下，經(jīng)由變性尿素-聚丙烯酰胺凝膠（Urea-PAGE）將產物分離純化，通過膠回收后轉入超濾離心管將目的樣品進一步純化，獲得高純轉錄本。而后將純化所得RNA樣本經(jīng)重折疊后，由懸浮蒸汽擴散法（hanging drop vapor diffusi

7、on method）獲得并篩選晶體。在實驗中，初步測試了晶體條件，獲得了部分SAM-Ⅳ晶體。
　　2. SAM-Ⅳ結構優(yōu)化及SHAPE分析
　　根據(jù)不同種菌體的SAM-Ⅳ核糖開關設計不同的突變構型，并對用于SHAPE分析的核糖開關結構進行優(yōu)化，以甄別各部分的功能及核糖開關作用機理。SAM-Ⅳ RNA準備同前，由生物公司合成并插入質粒，得到pUC57_SAM-Ⅳ_SHAPE模板，再經(jīng)PCR、體外轉錄、膠分離純化回收等步驟獲得高

8、純樣本RNA。最后通過SHAPE分析實驗及測序儀分析得知SAM的存在使SAM-Ⅳ RNA折疊及整體三維結構更加穩(wěn)定，同時精確定位了SAM-Ⅳ RNA與SAM的結合位點。而且還揭示了SAM的結合依賴于SAM-Ⅳ構型中P5部分的參與，推測其分子調節(jié)的機制跟P5部分有直接關系。
　　3.體外轉錄體系優(yōu)化
　　優(yōu)化體外轉錄體系，旨在高效獲取RNA產物。體外轉錄被廣泛用于分子生物學及結構生物學。鑒于一般轉錄RNA產量較低，故針對其部分

9、條件進行優(yōu)化，包括鎂離子補加時間，鎂離子補加濃度，NTP加入濃度，NTP補加濃度，反應總時間及無機焦磷酸酶等幾個方面。實驗中利用所掌握的資料及專業(yè)知識確定影響因素并設計正交實驗，再通過方差分析，多重比較等方法得到了優(yōu)化結果，即補加時間，M g2+補加濃度，反應總時間，無機焦磷酸酶的添加等方面不對結果造成影響，屬次要因素，NTP補加濃度為20mM/L，NTP加入濃度為25mM/Lamp;nbsp;時，RNA產量提升了300％。
　　

10、本課題旨在利用晶體測試及SHAPE分析對SAM-Ⅳ核糖開關的結構和功能進行研究。同時，還對體外轉錄體系進行優(yōu)化，提升了RNA的產量。實驗中通過優(yōu)化SAM-Ⅳ核糖開關的結構，利用結晶測試獲得了部分 RNA晶體，且經(jīng) SHAPE數(shù)據(jù)分析，得知 SAM能夠穩(wěn)定SAM-Ⅳ的整體結構，并且準確定位了SAM-Ⅳ的SAM結合位點，同時發(fā)現(xiàn)P5在SAM的結合過程中有重要作用。并且經(jīng)正交實驗分析確定體外轉錄體系中當NTP補加濃度為20mM/L，NTP加入