利用桿狀病毒系統(tǒng)規(guī)模化生產(chǎn)rAAV1的研究.pdf

1、臨床研究及實(shí)驗(yàn)表明,基因治療的關(guān)鍵在于載體的選擇。發(fā)展至今,不同時(shí)期已有多種不同的載體應(yīng)用于基因治療中,如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、單純皰疹病毒載體、慢病毒載體、腺病毒及腺相關(guān)病毒載體等。各種載體都具有各自的優(yōu)點(diǎn)及缺陷。腺病毒載體的結(jié)構(gòu)及功能研究較為清楚,因其致病原性低,宿主范圍廣泛,包裝生產(chǎn)簡(jiǎn)單,可同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因等優(yōu)勢(shì)在基因治療中被廣泛應(yīng)用;但是腺病毒同樣存在靶向性差,表達(dá)外源基因時(shí)間短,容易引起較為強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)等諸多缺陷。
　　

2、目前國(guó)際上較為公認(rèn)的腺相關(guān)病毒(AAV)載體可以在一定程度上彌補(bǔ)這些不足。AAV對(duì)人體免疫原性低,幾乎無(wú)致病性,可介導(dǎo)目的基因長(zhǎng)效表達(dá),并且宿主范圍極為廣泛,能感染不同細(xì)胞周期的多種類(lèi)型細(xì)胞。己發(fā)現(xiàn)的AAV血清型至少有150多種,不同血清型的AAV可以靶向不同的細(xì)胞和組織,進(jìn)一步擴(kuò)大了AAV的應(yīng)用范圍。
　　 AAV1因其可以高效靶向骨骼肌,攜帶外源基因應(yīng)用于臨床研究和治療更為安全,已經(jīng)越來(lái)越多的被作為基因治療載體用于多種疾病的

3、治療。但是臨床研究對(duì)AAV1的需求量極高,一般滴度要達(dá)到1017VG/ml。傳統(tǒng)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染生產(chǎn)方式所得到的AAV容易被腺病毒污染,并且耗時(shí)耗力,過(guò)程繁瑣,實(shí)際操作很難達(dá)到臨床需要的用量。
　　 本研究采用二桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞生產(chǎn)系統(tǒng),期望探索出一套rAAV1規(guī)?；b生產(chǎn)的穩(wěn)定方法。桿狀病毒能夠?yàn)锳av的復(fù)制包裝提供必要的輔助元件,并且桿狀病毒不會(huì)像腺病毒和單純皰疹病毒一樣對(duì)人體產(chǎn)生毒性,又借助對(duì)昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9的感染性,在昆蟲(chóng)細(xì)

4、胞中懸浮生產(chǎn)重組AAV載體,是一種較為理想且能滿足臨床需求的新型重組AAV生產(chǎn)方式。
　　 本研究首先構(gòu)建完成了三個(gè)攜帶了AAV包裝所需的順式和反式作用元件的重組pFastBacDual質(zhì)粒:pFBD-AAV1RepiCapi和pFBD-AAV1RFP、pFBD-AAV1AT7(Avastin):利用重組pFastBacDual質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10TMBac感受態(tài)菌株,獲得Bac-AAV1RepiCapi和Bac-AAV1RFP、B

5、ac-AAV1AT7(Avastin),滴度分別為5.42×108 VG/ml、2.63×108VG/ml、5.95×1012VG/ml;采取二桿狀病毒系統(tǒng)成功包裝出重組AAV病毒rAAVlRFP、rAAV1-AT7(Avastin),rAAV1-RFP。100ml錐形瓶中包裝出的rAAV1-RFP病毒產(chǎn)量為3.7×1013vg,可達(dá)35TU/Cell,生產(chǎn)能力較強(qiáng);利用rAAV1-RFP感染細(xì)胞,熒光顯微鏡下觀察紅色熒光效果理想;運(yùn)用