EZH2和H3K27me3在食管鱗狀細胞癌中的表達及對食管癌細胞侵襲能力的影響.pdf

1、食管癌（Esophageal carcinoma, EC）是世界上最常見的癌癥類型之一。食管鱗狀細胞癌（Esophageal Squamous Cell Carcinoma, ESCC）和腺癌（Esophageal Adenocarcinoma, EA）是食管癌最常見的兩種類型。西方國家食管腺癌較多，而在中國食管鱗狀細胞是其中最主要的組織學類型。盡管在治療食管鱗狀細胞癌方面，外科手術、放療及化療已經(jīng)取得的很大的進步，但是食管鱗狀細胞癌患

2、者五年生存率仍不理想。晚期食管鱗狀細胞癌患者預后較差生活質量較低。因此，迫切的需要一個可靠的生物標志物來識別伴有高度不良預后的患者，并且指導其治療。
　　已經(jīng)報道表觀遺傳改變，包括DNA甲基化及組蛋白共價修飾，涉及各種腫瘤基因的沉默，促進腫瘤發(fā)生或者人類癌癥的進展。其中最重要的機制是通過EZH2沉默許多癌癥相關基因，EZH2可以使靶基因啟動子處組蛋白H3賴氨酸K27發(fā)生三甲基化。本研究利用免疫組織化學法分別檢測 EZH2及 H3K

3、27me3在食管鱗癌組織和相應正常食管組織中的表達及與其臨床生物學指標之間的關系，及與患者預后關系。并通過實時熒光定量RT-PCR（Real-time quantitative PCR，qRT-PCR）、Western-blot方法檢測EZH2及H3K27me3在食管癌細胞系中的表達，并通過Transwell侵襲小室及細胞劃痕實驗探討了EZH2對食管癌細胞侵襲和遷移的影響，以期為 EZH2及 H3K27me3作為判斷患者不良預后的指標提

4、供理論依據(jù)。主要研究內容和結果如下：
　　第一部分 EZH2和H3K27me3在食管鱗狀細胞癌組織中的表達及對預后的意義
　　目的：
　　探討EZH2和 H3K27me3在食管鱗狀細胞癌組織，相應正常組織中的表達及與其臨床生物學指標之間的關系，尤其是與預后關系。
　　方法：
　　1、實時定量PCR方法檢測96對食管鱗狀細胞癌及其癌旁組織中EZH2mRNA的表達。
　　2、應用免疫組織化學法檢測96例食

5、管鱗狀細胞癌組織及相應正常組織中 EZH2和 H3K27me3蛋白的表達，分析其與患者臨床生物學指標及其預后的關系。
　　結果：
　　1、食管鱗狀細胞癌標本EZH2 mRNA水平明顯高于癌旁組織。96例食管鱗狀細胞癌組織中EZH2的陽性率為84.4％(81/96)；而相應癌旁組織中EZH2高表達占51.0%(49/96)。
　　2、EZH2和 H3K27me3蛋白在食管鱗狀細胞癌組織中表達陽性率明顯高于癌旁組織。在食管

6、鱗狀細胞癌細胞中，EZH2在細胞質和細胞核中均有表達，但是 H3K27me3則僅表達在細胞核中。EZH2和 H3K27me3在食管鱗狀細胞癌癌旁組織表達陽性率分別占44.8%(43/96)和26.0%(25/96)，低于食管鱗狀細胞癌組織70.8%（68/96）和47.9%（46/96）。
　　3 EZH2和 H3K27me3表達與食管鱗狀細胞癌患者病理學特征的關系。EZH2蛋白的表達與患者的年齡、性別、腫瘤部位及腫瘤分期不相關(

7、P?0.05)。EZH2蛋白的表達與食管鱗狀細胞癌患者組織學分級、淋巴結轉移及遠位轉移呈正相關(P＜0.05)。H3K27me3蛋白表達與患者的年齡、性別、腫瘤部位、及腫瘤分期無關(P?0.05)。H3K27me3蛋白表達與食管癌患者組織學分級、淋巴結轉移及淋巴結遠位轉移呈正相關(P＜0.05)。
　　4 EZH2和 H3K27me3表達與食管鱗狀細胞癌患者總生存期間的關系。Kaplan-Meier生存數(shù)據(jù)顯示EZH2表達陽性患者

8、的平均生存期41.175個月，明顯短于EZH2表達陰性患者(54.166個月)(χ2=13.218, P=0.000)。同樣，H3K27me3表達陽性的患者平均生存期38.677個月，明顯短于H3K27me3表達陰性患者(50.800個月)(χ2=15.990, P=0.000)。EZH2和H3K27me3表達均陽性的患者平均生存期為36.136個月，明顯短于僅有一種蛋白陽性患者(48.027個月)或者兩個蛋白均陰性患者(55.627個

9、月)。
　　5 Cox回歸分析數(shù)據(jù)表明EZH2表達(HR,3.574;95%CI,1.742-7.331;P=0.001)、組織學分級(HR,2.042;95%CI,1.200-3.475;P=0.008)及淋巴結遠位轉移(HR,8.667;95%CI,4.280-17.547;P?0.001)是影響食管鱗狀細胞癌患者預后的獨立因素。盡管 H3K27me3并沒有顯示出是影響食管鱗狀細胞癌患者獨立的預后因素，但是共表達 EZH2和

10、H3K27me3與食管鱗狀細胞癌患者遠位轉移呈正相關(χ2=15.681;P=0.000)。
　　結論：
　　EZH2和 H3K27me3可以作為食管鱗狀細胞癌患者預后不良的生物標志物。
　　第二部分 EZH2和H3K27me3在食管鱗狀細胞癌細胞株中的表達及其對食管癌細胞侵襲能力的影響
　　目的：
　　檢測食管癌細胞株KYSE30、KYSE170、TE1、Eca109細胞中EZH2的表達，并通過轉染 EZ

11、H2過表達載體或 shEZH2載體研究 EZH2與H3K27me3的關系及對食管癌細胞侵襲能力的影響。
　　方法：
　　1應用 qRT-PCR、Western Blot方法檢測食管癌細胞株 KYSE30、KYSE170、TE1、Eca109中EZH2的表達情況。
　　2應用 qRT-PCR、Western Blot方法檢測食管癌細胞過表達/沉默EZH2對H3K27me3基因表達水平的影響。
　　3應用qRT-PC

12、R分析食管癌細胞過表達/沉默EZH2對MMP1、MMP2、MMP7及 MMP9基因表達水平的影響。
　　4通過劃痕實驗分析過表達/沉默 EZH2后食管癌細胞的遷移運動能力。
　　5通過Transwell實驗分析過表達/沉默EZH2后食管癌細胞的侵襲能力。
　　結果：
　　1 qRT-PCR及Western Blot結果顯示Eca109及 TE1細胞中EZH2和H3K27me3明顯高于KYSE30及 KYSE170

13、細胞中EZH2和 H3K27me3表達水平（P＜0.05）。
　　2 Western Blot結果顯示過表達EZH2質粒的KYSE30和 KYSE170食管癌細胞系中H3K27me3蛋白的表達水平顯著高于對照組（P＜0.05）。
　　3 Western Blot結果顯示EZH2沉默組的Eca109及 TE1食管癌細胞系中H3K27me3蛋白的表達水平顯著低于對照組（P＜0.05）。
　　4 qRT-PCR結果顯示 KY

14、SE30和 KYSE170食管癌細胞轉染 EZH2后MMP1、MMP2、MMP7及 MMP9 mRNA水平較對照組相比明顯升高（P＜0.05）。Transwell侵襲實驗顯示 KYSE30及KYSE170轉染 EZH2組侵襲能力顯著高于對照組（P＜0.05）。細胞劃痕實驗顯示與對照組相比轉染EZH2組KYSE30及KYSE170細胞遷移能力明顯增強（P＜0.05）。
　　5 qRT-PCR結果顯示ShEZH2質粒轉染Eca109和

15、TE1食管癌細胞系后MMP1、MMP2、MMP7及 MMP9 mRNA水平較對照組相比明顯降低（P＜0.05）。Transwell侵襲實驗表明Eca109和TE1細胞轉染ShEZH2質粒組穿過Transwell侵襲小室細胞數(shù)顯著低于對照組細胞數(shù)（P＜0.05）。細胞劃痕實驗顯示與對照組相比轉染ShEZH2質粒組Eca109和TE1細胞遷移能力明顯降低（P＜0.05）。
　　結論：
　　EZH2可增加靶基因啟動子上組蛋白H3第