基于轉錄組分析的菜蛾盤絨繭蜂畸形細胞調控寄主的分子機制研究.pdf

1、1、菜蛾盤絨繭蜂畸形細胞的發(fā)育和形態(tài)
　　 菜蛾盤絨繭蜂寄生寄主小菜蛾36h后，其胚胎兩端的漿膜層開始解離形成畸形細胞，并在寄生48h后寄生蜂卵孵化時擴散到寄主血淋巴中。寄生2d后解剖，每頭寄生后的小菜蛾獲得畸形細胞94±7個，寄生5d后達到最大值144±13個，此后開始下降直至幼蜂在寄主體內發(fā)育結束;初產生的細胞直徑15.05±0.73μm，并持續(xù)增大，至寄生后7d后達到最大值57.49±5.38μm，寄生8d后略有減小;光學

2、顯微鏡和掃描電鏡的觀察結果顯示畸形細胞在不同的發(fā)育時期均為近球形，體積不斷增大，微絨毛分布規(guī)則且密度持續(xù)增大。離體培養(yǎng)時，寄生2d后每個寄生蜂胚胎產生畸形細胞96±8個，寄生6d后達到最大值151±10個并維持這一水平直至寄生8d后;初產生的畸形細胞直徑16.14±0.98μm，并在發(fā)育過程中維持這一水平;光學顯微鏡和掃描電鏡的觀察結果顯示離體培養(yǎng)的畸形細胞初產生時近球形，發(fā)育過程中形狀逐漸變得不規(guī)則，體積增長趨勢不明顯，細胞表面微絨毛

3、較為稀疏，分布雜亂。
　　 2、菜蛾盤絨繭蜂畸形細胞的轉錄組測定和分析
　　 菜蛾盤絨繭蜂畸形細胞的轉錄組測序共產生總堿基數為1，254，124，980的6，967，361條reads、233，765個contig、38，706個scaffold和24，165個unigene。分別對contig、scaffold和unigene長度的分布進行分析發(fā)現絕大多數序列長度小于400bp。Nr注釋結果顯示共有63.5％的unig

4、ene（15，340個）比對上數據庫中的15，043個已知基因?？勺⑨屝蛄兄?9％的比對結果E值介于1.0E-50到1.0E-5之間;相似度的分析發(fā)現44％的序列與比對上序列的相似度介于60％-80％之間;對比對上的已知序列47％來自于黑腹果蠅、西方蜜蜂、岡比亞按蚊和麗蠅蛹集金小蜂。
　　 根據基因注釋的結果，畸形細胞轉錄組測序所得序列鑒定得到以下類群功能基因:①寄生蜂幼蟲營養(yǎng)攝取的相關基因，主要包括trehalase、matr

5、ixmetalloproteinase14、fatty acid binding protein和hexamerin等;②對寄主生理調控的相關基因，如gamma-glutamyl cyclotransferase-like venom protein、juvenilehormone esterase、teratocytes secreted protein14、venom protein8、endochitinase和cysteine-

6、rich/pacifastin venom protein等;（③抑制寄主免疫的相關基因，主要包括venom protein Vn4.6、venom protein Vn50、C-type lectin等;④毒素基因，主要包括venom allergen5和venom acid phosphatase A2;⑤抗菌肽基因，包括definsin等;⑥微絨毛組裝的相關基因，主要包括ezrin-radixin-moesin、supervill

7、in和fambrin等。
　　 3、菜蛾盤絨繭蜂畸形細胞的數字基因表達譜測序
　　 1、3、5日齡畸形細胞（teratocytes-1d、teratocytes-3d和teratocytes-5d）的數字基因表達譜測序分別得到5，895，449、6，272，972和6，214，769條reads，比對上轉錄組中的序列數分別為14，504、11，772和13，917個。相關性分析發(fā)現teratocytes-1d和terat

8、ocytes-5d相關性最小。GO注釋結果顯示，比對結果為cellkilling、protein tag的基因只在3日齡畸形細胞中表達，比對結果為nutrientreservoir activity的基因只在3日齡和5日齡畸形細胞中表達，比對上其他功能類別的基因在不同發(fā)育時期的表達較為類似。
　　 功能基因表達模式研究發(fā)現，寄生蜂幼蟲營養(yǎng)攝取相關基因中trehalase前期表達量很高，并隨著細胞的發(fā)育逐漸降低;matrix me

9、talloproteinase14基本在細胞發(fā)育后期表達，fatty acid binding protein則細胞發(fā)育早期表達量較高，并逐漸降低;hexamerin基因隨細胞發(fā)育表達量逐漸增加。涉及對寄主發(fā)育調控的6類基因有3種表達模式，juvenile hormone esterase和teratocytes secreted protein14在細胞發(fā)育前期有較高的表達，其他發(fā)育階段表達量較低;venom protein8和cys

10、teine-rich/pacifastin venom protein只在細胞發(fā)育末期表達;gamma-glutamylcyclotransferase-like venom protein和endochitinase在細胞發(fā)育不同時期表達水平相差不多。抑制寄主免疫相關基因、抗菌肽和毒素基因主要在細胞發(fā)育后期表達。涉及微絨毛組裝的基因細胞發(fā)育前期和中期表達水平較高，后期有所降低。
　　 4、寄生蜂幼蟲營養(yǎng)攝取相關基因的克隆和表達

11、
　　 用qPCR對unigene19276(trehalase)、unigene5800(matrix metalloproteinase14)、unigene20417(fatty acid binding protein)和unigene10893(hexamerin)的表達模式進行驗證，發(fā)現unigene19276主要在前期（2日齡畸形細胞）表達，而unigene5800則主要在后期（5日齡畸形細胞）表達，unigene

12、10893的表達量呈逐漸緩慢增加的趨勢，unigene20417在發(fā)育早期（1-4日齡畸形細胞）發(fā)育過程中表達較為穩(wěn)定，后期（5日齡畸形細胞)略有降低。
　　 克隆得到unigene5800的全長cDNA序列，命名為MMP-14，基因序列全長2，052bp，1，791bp的開放閱讀框編碼一個66.35kD的蛋白;N末端有一個信號錨序列;氨基酸序列上分布有3個保守功能域，依次為PG_binding_1 s、ZnMc_ MMP和HX

13、;構建表達載體pET-28-MMP-14并原核表達得到一個大于70kD的蛋白。
　　 5、調控寄主發(fā)育相關基因的克隆和表達
　　 用qPCR對unigene4760(gamma-glutamyl cyclotransferase-like venomprotein)、unigene14814(juvenile hormone esterase)、unigene17429(teratocytessecreted prote

14、in14)、unigene20419(venom protein8)、unigene20917(endochitinase)和unigene18359(cysteine-rich/pacifastin venom protein)的表達模式進行驗證。Unigene4760在4、5日齡時表達量顯著高于1、2日齡;unigene14814和unigene17429在1日齡時的表達量均顯著高于其它時期，unigene17429在4日齡時也有一

15、個表達高峰;unigene20419、unigene20917和unigene18359在5日齡時的表達量顯著高于其它時期。
　　 對unigene4760和unigene17429進行克隆，得到兩個全長分別為665bp和585bp的基因序列，命名為TSVP-GGCT和TSP-13。TSVP-GGCT包含一個558bp的開放閱讀框，編碼分子量21.37kD的蛋白;無信號肽;含有一個GGCT_ like功能域;構建表達載體pET-

16、28-TSVP-GGCT并原核表達得到一個26kD左右的蛋白，制備的多克隆抗體可以與菜蛾盤絨繭蜂毒液蛋白發(fā)生免疫反應。TSP-13基因342bp的開放讀碼框編碼一個12.9kD的蛋白質，有信號肽序列，無保守功能域，構建表達載體pET-32-TSP-13但沒有表達出相應的蛋白。
　　 6、抑制寄主免疫相關基因的克隆和表達
　　 qPCR對unigene20181(venom protein Vn4.6)、unigene23

17、309(venom proteinVn50)和unigene20101(C-type lectin)的基因表達模式進行驗證發(fā)現主要在細胞發(fā)育后期表達。
　　 克隆得到unigene20181、unigene23309、unigene23761等3個基因的cDNA全長序列，分別命名為TSVP-8、TSVP-42和TSVP-SEP。TSVP-8的cDNA全長為454bp，含有一個216bp的開放讀碼框，編碼分子量為7.97kD的蛋白

18、質;有信號肽序列;無保守功能域。TSVP-42的cDNA全長為1314bp，含有一個1143bp的開放讀碼框，編碼分子量為41.94kD的蛋白質;無信號肽序列;包含一個Tryp_SPc保守功能域。TSVP-SEP的cDNA全長為1389bp，含有一個1116bp的開放讀碼框，編碼分子量為40.68kD的蛋白質，有信號肽序列，包含一個Tryp_SPc保守功能域。構建表達載體pET32-TSVP-8和pET28-TSVP-42分別表達出一個

19、小于26kD和大于43kD的蛋白質，pET28-TSVP-SEP則未表達出相應的蛋白質。重組蛋白制備多克隆抗體可以與菜蛾盤絨繭蜂的毒液蛋白發(fā)生免疫反應。進一步研究發(fā)現TSVP-8原核表達蛋白可以抑制寄主血淋巴的黑化。
　　 7、毒素基因的克隆和表達
　　 用qPCR對unigene8816(venom allergen5)和unigene19070(venom acidphosphatase A2)的基因表達模式進行驗證

20、，發(fā)現這兩個基因均以細胞發(fā)育后期表達為主。
　　 克隆unigene8816的cDNA得到一個全長1085bp的序列，命名為TSVP-allergen，含有一個長825bp的開放讀碼框，編碼分子量為30.8kD的蛋白質，有信號肽序列，包含一個屬于SCP超家族的保守功能域。構建表達載體pET-TSVP-allergen并原核表達得到一個55kD左右的蛋白質。蛋白質純化后制備得到的多克隆抗體可以與菜蛾盤絨繭蜂的毒液蛋白發(fā)生免疫反應。