PsGK4和PsIMPA1調控大豆疫霉無性繁殖過程中相關因子的初步鑒定.pdf

1、大豆疫霉（Phytophthora sojae）引起的大豆根腐病是大豆生產上的主要病害之一，每年給全世界的大豆生產造成重大的經(jīng)濟損失。如何防控大豆疫霉根腐病是生產中面臨的重要問題。在大豆疫霉的生活史中，其無性繁殖可以產生孢子囊，孢子囊在合適的條件下釋放大量游動孢子并進行傳播，導致大豆發(fā)病成災。在田間傳播過程中，大豆疫霉釋放游動孢子識別寄主根部分泌的化學物質，依靠趨化性定向游動，從而定殖到大豆根部。因此，探究大豆疫霉孢子囊的發(fā)育、游動孢子

2、的釋放及其趨化性等無性繁殖過程中的分子機制，有助于我們發(fā)現(xiàn)該類病害防控的分子靶標，為抗病分子設計奠定基礎。
　　在本實驗室前期的研究中，已經(jīng)對大豆疫霉無性繁殖過程中相關的分子機制進行了初步的研究。發(fā)現(xiàn)G蛋白信號途徑中的G蛋白α亞基編碼基因PsGPA1沉默后顯著影響游動孢子的趨化性，G蛋白偶聯(lián)受體（G protein coupled receptor，GPCR）編碼基因PsGPR11沉默突變體的休止孢萌發(fā)率與野生型相比下降40％左右

3、，另一個基因PsGK4則顯著影響無性發(fā)育時休止孢的萌發(fā)以及游動孢子的趨化性;MAPK信號通路中的MAPK編碼基因PsMPK7沉默后，休止孢萌發(fā)后芽管畸形，同時對大豆的致病力也明顯下降，而PsMPK1則參與調控大豆疫霉的菌絲生長和游動孢子形成;沉默核質轉運過程相關的一個親核蛋白編碼基因PsIMPA1后，孢子囊的萌發(fā)率及致病力明顯下降;SNARE蛋白家族基因PsSYP6的沉默顯著影響孢子囊的產量及其正常發(fā)育。為了進一步鑒定更多的大豆疫霉無性

4、繁殖相關因子，并探索他們之間的相互關系，本研究以前期鑒定的PsGK4和PsIMPA1為基礎，擬分別篩選其相關的互作蛋白和轉錄水平上有聯(lián)系的相關基因。主要研究內容如下:
　　大豆疫霉G蛋白偶聯(lián)受體PsGK4的互作蛋白篩選。前期研究發(fā)現(xiàn)PsGK4對游動孢子的游動性、異黃酮的趨化性和病菌的致病力有重要貢獻，且PsGK4在細胞中定位在囊泡結構上。在此基礎上進一步篩選PsGK4的互作蛋白可能對了解其相關的信號網(wǎng)絡，理解疫霉菌無性繁殖和游動孢

5、子趨化性的分子機制等具有重要的意義。本研究通過免疫共沉淀的方法篩選大豆疫霉PsGK4的互作蛋白，共獲得了70個候選互作蛋白。由于PsGK4的全長蛋白難以表達，我們最終使用其N端57個氨基酸的亞結構域（GPCR七次跨膜域中第一個囊泡膜外的肽段）。通過被鑒定肽段的匹配數(shù)及對候選互作蛋白的功能預測，我們最終挑取了3個蛋白進行深入的研究，包括:Ps330899、Ps359771和Ps247465。其中Ps359771蛋白含有一個烯醇化酶功能域(

6、Enolase domain，因此將其命名為PsEnol)，烯醇化酶在真核細胞表面可以作為人體凝血酶原的受體參與調控肌肉生成和瘤組織的發(fā)展;Ps247465蛋白含有一個Sec23 domain(命名為PsSec23)，該類蛋白是COPII型囊泡外被蛋白復合體的組分之一，可以介導囊泡從內質網(wǎng)向高爾基體的定向運輸;Ps500558蛋白含有一個Rab-GTPase-TBC domain（命名為PsRGTC），可能與囊泡蛋白復合體互作來調控囊泡

7、的定向運輸過程。通過原核誘導表達在體外分別進行上述蛋白與PsGK41-57aa肽段的GST Pull-down互作驗證，初步結果中均未發(fā)現(xiàn)這些蛋白與PsGK41-57aa有互作關系。該實驗有待于通過優(yōu)化蛋白表達量、蛋白表達的完整性或使用其他互作分析方法等進一步驗證。其他篩選到的候選互作蛋白也有待進一步分析驗證。
　　通過大豆疫霉PsIMPA1基因沉默突變體的轉錄組分析篩選可能與無性繁殖相關的基因。親核蛋白是真核細胞中十分保守的一類

8、蛋白質家族，負責細胞中的核質轉運過程，即將細胞質中的大分子物質運輸?shù)郊毎酥?，從而調控特定基因的轉錄表達，或將轉錄的mRNA運輸?shù)郊毎|中進行蛋白翻譯。實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)PsIMPA1沉默后，突變體不能產生孢子囊及游動孢子，且侵染大豆過程中不能有效清除活性氧，導致致病能力顯著下降。本研究利用RNA-seq探究了大豆疫霉PsIMPA1基因沉默突變體在菌絲階段和孢子囊階段中（與野生型相比）基因表達模式的變化。結果發(fā)現(xiàn)大豆疫霉PsIMPA1的