肥胖差異性蛋白14-3-3γ的驗(yàn)證及其機(jī)制研究.pdf

1、研究目的：核實(shí)通過(guò)利用蛋白組學(xué)技術(shù)篩選出差異性最顯著蛋白Pin 1及14-3-3 γ的準(zhǔn)確性，研究Pin 1及14-3-3 γ在肥胖發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮的作用。
　　 研究方法：1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：50只4周齡雄性C57BL/6J小鼠，隨機(jī)分組分為高脂組和低脂組，分別給予高脂及低脂飲食14周，于0周、4周、14周留取小鼠附睪周圍白色脂肪組織標(biāo)本，在mR N A及蛋白水平驗(yàn)證Pin 1及14-3-3 γ的表達(dá)是否與蛋白組學(xué)篩選的結(jié)果一致。2.

2、選擇其中一個(gè)蛋白，即14-3-3 γ，進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)：3T3-L1脂肪細(xì)胞培養(yǎng)，分別于d 0、d 2、d 4、d 8、d 10、d 12天留取細(xì)胞標(biāo)本，在mRNA及蛋白水平觀察14-3-3 γ在脂肪細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程當(dāng)中的表達(dá)變化。3.體外實(shí)驗(yàn)：①siRNA 介導(dǎo)3T3-L1脂肪細(xì)胞14-3-3 γ的基因沉默：同上的3T3-L1細(xì)胞培養(yǎng)誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞，外源性siRNA 片段及作為陰性對(duì)照的mo c k 片段由上海吉?jiǎng)P生物技術(shù)公司代為

3、合成，d-2天進(jìn)行外源性siRNA 片段轉(zhuǎn)染，mock為對(duì)照。②基因沉默14-3-3 γ后脂肪細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變：基因沉默14-3-3 γ在3T3-L1脂肪細(xì)胞中的表達(dá)后，mo r k為對(duì)照，d 8天對(duì)脂肪細(xì)胞進(jìn)行油紅染色，顯微鏡下觀察脂肪細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變。③影響脂肪細(xì)胞分化的機(jī)制研究：基因沉默14-3-3 γ后，分析對(duì)脂肪細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中重要的調(diào)節(jié)因子PPAR γ及C/EBP α在d 8天及d 6天在mR N A水平的表達(dá)的改變。

4、r>　　 研究結(jié)果：1.在4周時(shí)，相對(duì)于低脂組，高脂組小鼠附睪周圍脂肪組織中Pin 1的表達(dá)水平降低，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．05）；高脂組小鼠附睪周圍脂肪組織中14-3-3 γ的表達(dá)水平升高，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．05）；這與蛋白組學(xué)篩選的結(jié)果一致。2.在脂肪細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程當(dāng)中，14-3-3 γ 從d 0天到d 8天表達(dá)水平逐漸升高，d 8時(shí)達(dá)到高峰，隨后表達(dá)水平逐漸降低。這提示14-3-3 γ與脂肪細(xì)胞的分化密切相關(guān)。3.si

5、RNA 介導(dǎo)3T3-L1脂肪細(xì)胞14-3-3 γ的基因沉默，m o r k為陰性對(duì)照，d 8天對(duì)脂肪細(xì)胞進(jìn)行油紅染色，顯微鏡下觀察脂肪細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變，發(fā)現(xiàn)沉默后的3T3-L1脂肪細(xì)胞同一視野下與對(duì)照相比脂滴數(shù)目變少，體積變小。這提示14-3-3 γ基因沉默后的脂肪細(xì)胞分化受到抑制。4.與mo c k 相比，14-3-3 γ基因沉默后的脂肪細(xì)胞中，調(diào)節(jié)因子PPAR γ及C/EBP α在d 8天及d 6天mR N A水平的表達(dá)降低。這提示