α-酮戊二酸脫氫酶復合體基因克隆以及在大腸桿菌中的表達研究.pdf

1、α-酮戊二酸脫氫酶復合物是三羧酸循環(huán)的關鍵酶，是由三個基因編碼的幾十個亞基組成的大分子酶蛋白。三個基因分別為sucA，sucB和lpdA。其中sucA編碼α-酮戊二酸脫氫酶，sucB編碼二氫硫辛酸轉琥珀酰酶，lpdA編碼二氫硫辛酸脫氫酶，三種亞基分子量大小分別為94,000D、47,000D和54,000D，通過非共價鍵結合在一起。具有天然活性的僅．酮戊二酸脫氫酶復合物的亞基組成為：12個α-酮戊二酸脫氫酶鏈，24個二氫硫辛酸轉琥珀酰酶

2、鏈以及12個二氫硫辛酸脫氫酶。實驗表明，24個二氫硫辛酸轉琥珀酰酶鏈可以結合6個α-酮戊二酸脫氫酶二聚體和18個二氫硫辛酸脫氫酶二聚體。然而，只有在結合6個二氫硫辛酸脫氫酶二聚體時α-酮戊二酸脫氫酶復合物才表現(xiàn)出最大的活性。 本文通過文獻檢索獲得已發(fā)表的大腸桿菌K12全基因組序列，然后以此為依據(jù)設計α-酮戊二酸脫氫酶復合物基因引物，以大腸桿菌K12染色體DNA為模板，用PCR技術分別擴增了編碼α-酮戊二酸脫氫酶復合物的基因序列

3、sucAB和lpdA。PCR產物純化后，sucAB用EcoR I和Sal I雙酶切，lpdA用Sal I和Hind Ⅲ雙酶切，分別與經過相同酶切處理的質粒pUC18連接，連接產物轉化大腸桿菌Ecoli JM109，在含有氨芐青霉素抗性的麥康凱培養(yǎng)基平板上篩選到陽性轉化子。經過提取質粒和酶切驗證后，初步證明連接成功。將構建好的質粒pUC18-sucAB和pUC18-lpdA送上海博亞生物技術有限公司進行測序后，證明克隆得到的基因序列與所發(fā)

4、表的大腸桿菌K12全基因組序列中相關序列相同。為了使編碼α-酮戊二酸脫氫酶復合物各基因串連表達，將質粒pUCl8-sucAB和pUC18-lpdA均用EcoR I和Sal I雙酶切，然后回收所需的片斷，用T4DNA連接酶進行連接，得到了目標質粒pUC18-sucAB-lpdA，連接產物轉化大腸桿菌E.coliJM109，在含有氨芐青霉素抗性的麥康凱培養(yǎng)基平板上篩選陽性轉化子。經過提取質粒和酶切驗證后，證明各基因串連連接成功。大腸桿菌JR

5、G301和JRG465均為a-酮戊二酸脫氫酶基因缺陷型菌株，兩者中編碼a-酮戊二酸脫氫酶復合物的部分基因分別被突變，其中JRG301編碼的 lpdA基因發(fā)生突變，JRG465中編碼的sucA基因發(fā)生突變，菌株從而無法依靠自身基因編碼出完整的具有活性的a-酮戊二酸脫氫酶復合物。為了驗證我們構建的質粒pUC18-sucAB，pUC18-lpdA和pUC18-sucAB-lpdA在大腸桿菌中的表達活性，將質粒pUC18-sucAB轉化JRG4

6、65缺陷型菌株，質粒pUC18-lpdA轉化JRG301缺陷型菌株，質粒pUC18-sucAB-lpdA同時轉化JRG465和JRG301兩種缺陷型菌株。成功獲得各轉化子后，分別大量培養(yǎng)獲取細胞，用超聲波法破碎細胞，得到轉化子細胞的胞內上清液，測定a-酮戊二酸脫氫酶復合物的酶活性，同時用大腸桿菌野生型K12、不含質粒的缺陷型菌株JRG301和JRG465作為對照。在JRG465(pUC18-sucAB)中測得活性，可以證明基因sucAB

7、的表達。在JRG301(pUC18-lpdA)中測得活性，可以證明基因lpdA的表達。在JRG465(pUC18-sucAB-lpdA)和JRG301(pUC18-sucAB-lpdA)中都測得酶活性，可以證明串聯(lián)基因sucAB-lpdA均得到了表達。結果表明，在轉化后的大腸桿菌a-酮戊二酸脫氫酶基因缺陷型菌株JRG465和JRG301中，均測得比較高的a-酮戊二酸脫氫酶活性，且其表達量明顯比大腸桿菌野生型K12高，這可能是由于載體質粒

8、pUC18的多拷貝所導致的，證明克隆基因在自身啟動子的帶動下，在大腸桿菌中能夠得到很好的表達，為下一步在硫細菌中的表達奠定了堅實的基礎。為了進一步證明克隆基因確實在大腸桿菌僅．酮戊二酸脫氫酶基因缺陷型菌株JRG465和JRG301中得到了表達，我們用JRG465(pUC18-sucAB-lpdA) 和JRG301(pUCl8-sucAB-lpdA)菌株破碎細胞后的上清液進行了SDS-PAGE電泳，并用不含質粒的缺陷型菌株JR

9、G465、JRG301以及大腸桿菌野生型K12作為對照，結果表明,在預期出現(xiàn)條帶的94，000D、47，000D和54，000D處，含有質粒的缺陷型菌株以及野生型K12均出現(xiàn)了比較明顯的條帶，而對照的缺陷型菌株則沒有此對應條帶，且在含質粒的大腸桿菌α-酮戊二酸脫氫酶基因缺陷型菌株中，其條帶亮度明顯大于大腸桿菌野生型K12，這一結果與酶活測定的結果相符合。但是lPdA和sucB基因編碼的兩種蛋白，由于其分子量只相差7,000D，其分離效果