串聯親和純化及氨基酸代謝標記-改進的串聯親和純化研究蛋白質復合物及蛋白-蛋白相互作用.pdf

1、很多蛋白質功能是通過形成蛋白質復合體及其蛋白質-蛋白質間的相互作用共同實現的。蛋白質-蛋白質間的相互作用分析是功能基因組學及蛋白質組學的重要研究內容之一，是了解蛋白功能的途徑之一?，F在研究蛋白-蛋白相互作用的主要的方法是酵母雙雜交，但該方法的主要缺點是其較高的假陽性和假陰性結果，需要進一步的實驗來驗證分析。因此，本研究聯合運用分子克隆等分子生物學技術與親和純化、氨基酸代謝標記(穩(wěn)定同位素標記)及質譜等分析化學技術，主要發(fā)展了蛋白質復合體

2、串聯親和純化(TAP)方法，以及蛋白質-蛋白質相互作用研究的“氨基酸代謝標記-串聯親和純化-質譜新技術(AACT-TAP-MS)”，和基于氨基酸代謝標記技術的免疫共沉淀(AACT-IP)新方法；并在人肝癌細胞系中分別運用發(fā)展的TAP，AACT-TAP-MS方法分離鑒定了14-3-3(epsilon)蛋白復合體。本文研究內容主要集中在以下幾個方面： 1.改進發(fā)展適合于高等哺乳動物細胞的新的TAP系統和技術分離純化蛋白復合體。建立蛋

3、白混合物經過“Flag-antiFlagM2”和“鈣調素結合肽-鈣調素”兩次不同的親和結合、TEV酶酶切和SDS洗脫而分離純化蛋白復合物的新TAP方法，可在生理條件下簡單快速分離得到蛋白質復合物。與Rigaut當初在酵母中建立的“ProteinA-IgG”和“CBP-CM”的TAP方法相比，主要是在TAPtag載體中用兩個短的8肽Flag序列取代了ProteinA序列，分子量減小有利于靶蛋白與TAPtag載體更有效融合表達，且通過ant

4、i-Flag抗體來分離復合物特異性更強，有效減少非特異性蛋白的結合。 2.將蛋白定量分析的“氨基酸代謝標記-質譜技術”(AACT-MS)，與有效分離蛋白復合物的串聯親和純化標簽(TAPtag)方法有機整合發(fā)展，建立了d3-Leu氨基酸代謝標記-串聯親和純化-質譜新技術(AACT-TAP-MS)進行蛋白復合物分離純化、蛋白鑒定及繪制蛋白間直接相互物理作用圖譜的一體化新技術，提高蛋白質鑒定和定量分析的靈敏度和準確性。AACT-TAP

5、-MS新技術也為建立大規(guī)模、高通量、快速準確分析研究人類重要功能蛋白質連鎖網絡提供新的技術體系。 3.選擇人類重大疾病肝癌為研究對象，以人肝癌細胞為靶細胞，運用發(fā)展的AACT-TAP-MS新技術，從蛋白質間的相互作用、協同發(fā)揮功能的新角度，分離與肝癌發(fā)生發(fā)展密切關聯的蛋白14-3-3的復合物，鑒定了14-3-3zeta，14-3-3theta，actin，Bipprotein及HSP70等蛋白與14-3-3ε存在特異性相互作用。

6、本研究可為肝癌的早期診斷、預后尋找新的侯選蛋白標記物提供新方法。 4.發(fā)展了基于氨基酸同位素代謝標記技術的免疫共沉淀新方法來分離蛋白質復合體、分析蛋白質-蛋白質間相互作用。運用建立的AACT結合co-IP方法，鑒定出了與目的蛋白14-3-3β特異性相互作用的HSP90A，glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，14-3-3tau等蛋白。 總之，本研究工作不僅在蛋白質復合物分離以及與

7、AACT-MS聯用的方法學和研究蛋白質功能上具有重要的科學意義，可為哺乳動物細胞中其他蛋白復合物的TAP法純化，研究蛋白-蛋白相互作用提供新的技術方法。AACT-TAP-MS可為我國正在開展的“中國人類肝臟蛋白組計劃”及包括中國參與的國際合作項目“人類肝臟蛋白組計劃”中研究內容之一—繪制“人類肝臟蛋白質相互作用連鎖圖”，建立大規(guī)模、高通量、快速準確分析研究人類重要功能蛋白質連鎖網絡提供新的技術體系。本課題的研究思想和方法代表了系統生物學