TRADD調控RIP1非依賴的細胞程序性壞死及RIP3非依賴的細胞凋亡研究.pdf

1、細胞程序性壞死(programmed necrosis，necroptosis)是近年來鑒定的一種新的細胞程序性死亡方式，在炎癥反應、外源微生物入侵防御和胚胎發(fā)育等病理和生理過程中都發(fā)揮著重要調控作用。多種因素都能夠誘導細胞程序性壞死，其中腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor alpha，TNFα)誘導的細胞程序性壞死目前研究的最為廣泛。TNFα是一種多功能的細胞因子，與細胞膜上的受體(TNFα receptor1，

2、TNFR1)結合后促進 TNFR1胞內段構象發(fā)生改變，進而招募并結合具有死亡結構域的接頭蛋白，如 TRADD(TNF receptor1 associated death domain)和RIP1(receptor-interacting protein1)，形成復合體I（complex I），進而招募其他蛋白激酶，活化NFκB或MAPK信號通路，促進細胞生存和增殖。RIP1與TNFR1解離后進入細胞質，招募并結合RIP3(recept

3、or-interacting protein3)，形成”壞死復合體(necrosome)”，且兩者通過相互磷酸化或在其他蛋白的影響下磷酸化而激活，進而招募并結合 RIP3的底物蛋白 MLKL(mixed lineage kinase domain like pseudokinase)，促進 MLKL的磷酸化與多聚化，并轉移到細胞膜上與磷脂酰肌醇相結合，破壞細胞膜的結構，導致細胞程序性壞死。
　　RIP1是首個鑒定的細胞程序性壞死調

4、控蛋白，其別構抑制劑Necrostatin-1在細胞和疾病模型中都能顯著抑制細胞程序性壞死的發(fā)生。同時，敲低RIP1也能顯著抑制TNFα與Z-VAD聯合誘導的小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryo fibroblast，MEF)、3T3(過表達RIP3)和HT29等細胞的程序性壞死，表明RIP1是啟動細胞程序性壞死的必不可少的靶蛋白。但是，近期研究發(fā)現敲低L929細胞內的RIP1，并不抑制TNFα單獨或與Z-VAD聯合誘導的細胞死

5、亡，且這一現象在MEF細胞中得到進一步驗證，表明在敲低RIP1的L929或MEF細胞中TNFα可以通過其他機制來誘導細胞死亡，但這種細胞死亡的類型、調控靶點與機制目前并不清楚。
　　本研究以L929細胞為模型，利用慢病毒介導的RNA干涉技術構建了穩(wěn)定敲低RIP1及其他靶蛋白的L929細胞株，探索了TNFα誘導RIP1非依賴性細胞死亡的調控靶點與機制。我們發(fā)現RIP1敲低并不抑制TNFα誘導的細胞死亡，且細胞凋亡抑制劑Z-VAD-F

6、MK及caspase8敲低對細胞死亡過程中沒有抑制作用，表明RIP1非依賴的細胞死亡不是凋亡，而是程序性壞死。同時，TNFα在誘導RIP1非依賴的細胞程序性壞死促進RIP3及其底物蛋白MLKL的磷酸化和多聚化，且敲低RIP3或 MLKL能夠阻斷 RIP1非依賴的細胞程序性壞死，表明 TNFα通過活化RIP3/MLKL信號通路來誘導RIP1非依賴的細胞程序性壞死。RIP1可以通過結合TNFR1與RIP3來形成不同的蛋白復合體，進而促進細胞

7、程序性壞死信號從TNFR1傳遞到RIP3，但目前并無RIP3與TNFR1直接結合的相關報道，因此，在敲低RIP1的細胞中TNFα誘導的細胞程序性壞死信號如何從TNFR1傳遞到RIP3目前并不清楚。本研究發(fā)現RIP1敲低促進RIP3與TNFR1的結合，以及RIP3與TRADD的相互結合，但TRADD敲低則阻斷RIP3與TNFR1結合形成的蛋白復合體，表明TRADD能夠介導RIP3與TNFR1的結合，進而促進細胞程序性壞死信號的傳遞。同時，

8、我們發(fā)現敲低TRADD能夠完全抑制TNFα誘導的RIP1非依賴的細胞程序性壞死，以及RIP3/MLKL信號通路的活化，表明TRADD通過介導細胞程序性壞死信號的傳遞來啟動TNFα誘導的RIP1非依賴的細胞程序性壞死。此外，我們發(fā)現敲低RIP3能抑制TNFα與Z-VAD聯合誘導的細胞死亡，但并不阻斷TNFα單獨誘導的細胞死亡，表明RIP3敲低可導致TNFα誘導的細胞死亡方式由程序性壞死轉變?yōu)榧毎蛲?。同時，在RIP3非依賴的細胞死亡過程中

9、檢測到caspase信號通路的活化，且敲低caspase8能完全阻斷RIP3非依賴的細胞死亡，進一步驗證了RIP3非依賴的細胞死亡是細胞凋亡。由于敲低TRADD能夠顯著抑制RIP3非依賴的細胞凋亡，且TRADD在細胞凋亡過程中能結合caspase8并促進其活化，進而激活caspase信號通路，表明TRADD也是調控RIP3非依賴的細胞凋亡的重要靶點，并通過活化caspase信號通路來啟動細胞凋亡。因此，本研究發(fā)現TRADD是RIP1非依