RNA干擾矽肺纖維化相關基因CXCL11-CXCR3對人胚肺成纖維細胞I、III型膠原表達的影響.pdf

1、目的：本實驗購入人胚肺成纖維細胞（MRC-5細胞），通過 RNA干擾技術將CXCL11-SiRNA和CXCR3-SiRNA干擾質粒分別轉染入人胚肺成纖維細胞內，對矽肺纖維化相關基因CXCL11及CXCR3進行基因沉默，并用矽肺患者肺泡巨噬細胞培養(yǎng)上清刺激人胚肺成纖維細胞，觀察細胞I、III型膠原表達情況，探討CXCL11及CXCR3在矽肺纖維化中的作用。
　　方法：1獲取矽肺患者肺泡灌洗液，離心收集肺泡巨噬細胞（AM），觀察 AM

2、形態(tài)，并做常規(guī) HE染色、抗酸染色及瑞氏染色鑒定。用含 SiO2的空白培養(yǎng)基刺激AM18h，收集上清并過濾保存?zhèn)溆谩?構建 ShRNA表達質粒：在 Pubmed網站查詢獲得人類基因CXCL11及CXCR3的序列號，由上海吉瑪公司構建兩種基因的干擾質粒及相應的陰性質粒，質粒選取 pGPU6/GFP/Neo-shGAPDH為載體。3 CXCL11-SiRNA和CXCR3-SiRNA由 LipofectamineTM2000脂質體介導分別轉染

3、入人胚肺成纖維細胞內，用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察質粒轉染情況；轉染36～48h后提取各組細胞總 mRNA和總蛋白分別用 realtime-PCR和Western-blot法篩選兩個基因的最佳干擾序列。4實驗分為4組：空白對照組（C組），常規(guī)10％胎牛血清MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；刺激組（S組），常規(guī)10％胎牛血清MEM培養(yǎng)基中加入之前保存?zhèn)溆玫姆闻菥奘杉毎囵B(yǎng)上清；轉染組（T組），將篩選的最佳干擾質粒轉染人胚肺成纖維細胞后，常規(guī)10％胎牛血清

4、MEM培養(yǎng)基中再加入保存?zhèn)溆玫姆闻菥奘杉毎囵B(yǎng)上清；陰性質粒轉染組（N組），將陰性干擾質粒轉染細胞后，常規(guī)10％胎牛血清 MEM培養(yǎng)基中再加入保存?zhèn)溆梅闻菥奘杉毎囵B(yǎng)上清。5免疫細胞化學法和Western-blot法檢測I、III型膠原的表達：分別在 SiO2刺激后的12h、24h、36h、48h和72h檢測各組人胚肺成纖維細胞I、III型膠原蛋白的表達情況。
　　結果：1質粒轉染人胚肺成纖維細胞36～48h后，激光掃描共聚焦顯微

5、鏡觀察到綠色熒光蛋白在人胚肺成纖維細胞中均有表達，其中當質粒:LipofectamineTM2000脂質體=3μg:3μl時，轉染率最高，可高達90％以上。2提取各組總 mRNA和總蛋白，分別用realtime-PCR和Western-blot法篩選CXCL11和CXCR3干擾效果最好的序列：其中 CXCL11的最佳干擾質粒為 pGPU6/GFP/Neo-CXCL11-homo-352；CXCR3的最佳干擾質粒為 pGPU6/GFP/N

6、eo-CXCR3-homo-203；未轉染組和陰性質粒轉染組相比，統(tǒng)計學分析差異無顯著性（P＜0.05）。3免疫細胞化學法和Western-blot法檢測結果均顯示：空白對照組細胞均有少量I、III型膠原蛋白的表達；刺激組與同時間點空白對照組相比，I、III型膠原蛋白表達上調（P＜0.05）；轉染組與同時間點空白對照組相比，I、III型膠原蛋白表達上調（P＜0.05），但與同時間點刺激組相比，I、III型膠原蛋白表達下調（P＜0.05）