產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細菌的檢測及耐藥特點研究.pdf

1、研究背景：
　　腸桿菌科細菌是社區(qū)獲得性感染和醫(yī)院獲得性感染的重要條件致病菌，主要引起呼吸系統(tǒng)感染和泌尿系統(tǒng)感染，在免疫力低下的患者中可引起嚴重甚至致死性的感染。而碳青霉烯類抗菌藥物是目前臨床上作為治療腸桿菌科細菌感染最強而有力的一類抗菌藥物，包括亞胺培南、美羅培南、厄他培南等，其對極大多數(shù)由質(zhì)?；蛉旧w介導的β-內(nèi)酰胺酶都有較高的穩(wěn)定性，且與青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)親和力強，能有效地滲透細菌外膜，并存在抗生素后效應，因其抗菌譜

2、廣、抗菌活性強、殺菌作用快，臨床上碳青霉烯類抗菌藥物廣泛用于治療產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）和頭孢菌素酶（AmpC酶）細菌引起的感染。
　　但是隨著碳青霉烯類抗菌藥物的大量使用，國內(nèi)外開始報道對碳青霉烯類抗菌藥物不敏感甚至耐藥的腸桿菌科細菌，這極大地限制了碳青霉烯類抗菌藥物的使用，產(chǎn)生這一現(xiàn)象的重要原因是菌株獲得了碳青霉烯酶基因。其中由質(zhì)粒攜帶的碳青霉烯酶基因由于其耐藥基因環(huán)境存在介導轉(zhuǎn)移的基因元件，使得其易于在不同細菌間轉(zhuǎn)

3、移，造成了碳青霉烯酶耐藥性的廣泛傳播，成為近年臨床微生物學領域備受關(guān)注的熱點之一。
　　本研究通過采用法國梅里埃 Vitek2全自動微生物鑒定儀與藥物敏感儀對收集的耐藥菌株進行鑒定及藥敏分析，對本院可疑的產(chǎn)碳青霉烯酶菌株進行多重 PCR檢測碳青霉烯酶基因，并對耐藥基因陽性的菌株進行接合轉(zhuǎn)移實驗，以了解耐藥基因的傳播方式；通過高通量測序技術(shù)對其中一株接合轉(zhuǎn)移成功的多重耐藥菌株進行質(zhì)粒全序列的測定，獲得的全序列通過生物信息學分析，展開

4、對肺炎克雷伯菌耐藥基因環(huán)境及耐藥機制的研究。
　　研究目的：
　　了解本院臨床分離的腸桿菌科菌株的耐藥特點及產(chǎn)碳青霉烯酶情況，探討產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細菌耐藥基因的傳播方式及可能的耐藥機制，為臨床控制耐藥基因的傳播提供一定的實驗依據(jù)。
　　研究方法：
　　1.菌株收集和藥敏實驗收集廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科微生物室分離的來自不同科室的不同標本類型的耐碳青霉烯類抗菌藥物的腸桿菌科菌株共18株。全部菌株的鑒定及藥

5、敏實驗采用法國梅里埃Vitek2全自動微生物鑒定儀與藥物敏感儀完成，藥敏結(jié)果按美國臨床實驗室標準化協(xié)會（CLSI）M100-S222012版進行判讀。
　　2.菌株DNA模板的制備及多重PCR實驗菌株DNA模板的制備采用煮沸法，利用多重PCR方法對所有的菌株進行11種碳青霉烯酶基因blaIMP、blaSPM、blaAIM、blaVIM、blaOXA、blaGIM、blaBIC、blaSIM、blaNDM、blaDIM、blaKPC

6、的檢測，陽性 PCR產(chǎn)物送公司進行測序驗證，所得序列于網(wǎng)上BLAST比對，最終確定其基因亞型。
　　3.耐藥基因傳播方式研究對所有攜帶碳青霉烯酶基因的菌株進行質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移實驗并采用法國梅里埃 Vitek2全自動微生物鑒定儀與藥物敏感儀對接合子進行鑒定和檢測藥敏，藥敏結(jié)果按美國臨床實驗室標準化協(xié)會（CLSI）M100-S222012版進行判讀。對攜帶碳青霉烯酶基因的肺炎克雷伯菌株進行 MLST分型，以和國內(nèi)外已報道的情況進行比較。<

7、br>　　4.將多重耐藥菌株肺炎克雷伯菌（KP）DQ49與受體菌EC600進行接合實驗，PCR驗證接合成功后，利用細菌基因組DNA提取試劑盒提取接合子基因組DNA，并利用Illumina Miseq高通量測序平臺對其進行序列測定，得到的數(shù)據(jù)用Edena軟件拼接，并利用RAST網(wǎng)上注釋工具對得到的質(zhì)粒全序列進行注釋，使用網(wǎng)上序列比對工具BLAST進行耐藥基因環(huán)境分析，使用PlasmidFinder網(wǎng)上工具進行質(zhì)粒不相容性分析，使用ResF

8、inder網(wǎng)上工具進行耐藥基因分析，使用MLST網(wǎng)上工具進行ST分型分析。
　　研究結(jié)果：
　　1.藥敏結(jié)果18株耐碳青霉烯類抗菌藥物的腸桿菌科細菌中包括肺炎克雷伯菌12株、大腸埃希菌2株、陰溝腸桿菌2株、植生拉烏爾菌1株、弗氏檸檬酸桿菌1株；科室分布為重癥監(jiān)護病房13株、泌尿外科2株、心血管內(nèi)科1株、肝膽科1株、胃腸外科1株；標本類型為痰7株、中段尿2株、膽汁2株、腹腔引流液2株、插管導管1株、導管頭1株、血液1株、分泌物

9、1株、其他1株。經(jīng)檢測，18株菌對碳青霉烯類、青霉素類、β-內(nèi)酰胺類、單環(huán)內(nèi)酰胺類抗菌藥物表現(xiàn)出較強的耐藥性，表現(xiàn)為多重耐藥；但對氨基糖苷類的阿米卡星、慶大霉素，磺胺類的呋喃妥因、復方新諾明，甘氨酰環(huán)素類的替加環(huán)素，氟喹諾酮類的環(huán)丙沙星、左旋氧氟沙星的耐藥性卻有不同。
　　2.多重PCR檢測碳青霉烯酶基因結(jié)果用多重PCR對18株碳青霉烯類耐藥菌進行碳青霉烯酶基因檢測，發(fā)現(xiàn)這些菌株均攜帶碳青霉烯酶基因，全部送測序，其中8株為blaN

10、DM-1型，8株為blaKPC-2型，1株為blaVIM-1型，1株為blaIMP-26型。
　　3.耐藥基因水平傳播方式及肺炎克雷伯菌MLST結(jié)果在接合實驗中，有10株菌成功地將質(zhì)粒傳遞給受體菌EC600，其中包括肺炎克雷伯菌7株，大腸埃希菌2株，陰溝腸桿菌1株；8株通過電轉(zhuǎn)化實驗成功將質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至受體菌DH5α，其中包括肺炎克雷伯菌5株，陰溝腸桿菌1株，植生拉烏爾菌1株，弗氏檸檬酸桿菌1株。選取12株肺炎克雷伯菌進行MLST分析

11、，其中ST11型有10株，占大部分；ST20型1株；1株為ST2460，為首次報道。
　　4.通過接合實驗得到攜帶耐藥基因blaIMP-26的質(zhì)粒pIMP26_DQ49，對質(zhì)粒進行全序列測定。測序結(jié)果表明，pIMP26_DQ49屬于質(zhì)粒不相容群（Inc）中的IncN群，是大小為55179bp的環(huán)狀質(zhì)粒，攜帶三個耐藥基因，G+C含量為50.4％，預測編碼52個功能基因。BLAST發(fā)現(xiàn)pIMP26_DQ49與已報道的pIMP_HZ1序

12、列相似度高達99%，且攜帶的可移動基因元件也高度相似，其耐藥基因環(huán)境包含可導致轉(zhuǎn)座事件發(fā)生的IS903D、IS2、Tn2、Tn3、tnp、tnpA，以及能捕獲和整合外源性基因的1類整合子基因intI1。
　　結(jié)論：
　　耐碳青霉烯類抗菌藥物的腸桿菌科菌株均攜帶碳青霉烯酶基因，這些基因均可以通過接合實驗或電轉(zhuǎn)化實驗在同科細菌間水平轉(zhuǎn)移；肺炎克雷伯菌的質(zhì)粒 pIMP26_DQ49攜帶超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因blaTEM-1、氟喹諾