腎癌組織特異性復制缺陷型重組腺病毒的構建及鑒定.pdf

1、分類號：分類號：R69密級：密級：公開公開研究生學位論文論文題目（中文）論文題目（中文）腎癌組織特異性復制缺陷型重組腺病毒的構腎癌組織特異性復制缺陷型重組腺病毒的構建及鑒定建及鑒定論文題目（外文）論文題目（外文）Constructionidentificationoftumspecificreplicationdefectiverecombinantadenovirusinkidney研究生姓名研究生姓名張楊張楊學科、專業(yè)學科、專業(yè)外科

2、學科學泌尿外科學泌尿外科學研究方向研究方向泌尿系腫瘤泌尿系腫瘤學位級別學位級別碩士碩士導師姓名、職稱導師姓名、職稱田俊強田俊強副教授副教授論文工作起止論文工作起止20142014年7月至月至20162016年3月論文提交日期論文提交日期2012016年4月論文答辯日期論文答辯日期2012016年5月學位授予日期學位授予日期校址：甘肅省蘭州市校址：甘肅省蘭州市蘭州大學碩士研究生學位論文腎癌組織特異性復制缺陷型重組腺病毒的構建及鑒定腎癌組織

3、腎癌組織特異性復制缺陷型重組腺病毒的構建及鑒定特異性復制缺陷型重組腺病毒的構建及鑒定中文摘要中文摘要目的：目的：構建腎癌組織特異性復制缺陷型5型腺病毒Ad5CAIXE1AIREShrGFP1，該病毒攜帶腎癌組織特異性啟動子碳酸酐酶IX和報告基因人源型綠色熒光蛋白(hrGFP1)，為外周血中循環(huán)腫瘤細胞（CTCs）的檢測等后續(xù)研究奠定基礎。方法：方法：利用BglII、PmeI雙酶切穿梭質粒pShuttleCMVIREShrGFP1、pSh

4、uttleCAIXE1A分別得到目的片段hrGFP1及基因載體，T4DNA連接酶過夜連接，構建含有報告基因的重組穿梭質粒pShuttleCAIXE1AIERShrGFP1。轉化感受態(tài)細胞DH5α后經涂板、PCR、酶切鑒定，挑選陽性菌落大量擴增，獲取重組質粒。提取的陽性質粒經PmeI線性化，轉化含有骨架質粒AdEasy1的感受態(tài)細胞BJ5183，利用同源重組技術，構建病毒質粒pAd5CAIXE1AIREShrGFP1。經PCR、酶切共同鑒

5、定，陽性質粒轉化入感受態(tài)細胞DH5α中大量擴增、提取并凍存菌液。陽性質粒經PacI酶切后，線性化質粒利用Lipofectamin2000TM介導作用，轉染HEK293細胞，獲得重組腺病毒Ad5CAIXE1AIREShrGFP1，經4輪擴增后收集、純化病毒，檢測其滴度。結果：結果：成功構建重組穿梭質粒、重組腺病毒質粒并且完成其包裝過程。PCR和酶切的電泳結果顯示，hrGFP1基因成功嵌入重組穿梭質粒及腺病毒質粒，酶切分析與VectNTIA

6、dvance11軟件結果一致，證實重組穿梭質粒pShuttleCAIXE1AIREShrGFP1及腺病毒質粒pAd5CAIXE1AIREShrGFP1構建正確；在病毒包裝和后續(xù)四輪擴增過程中，重組腺病毒在HEK293細胞內熒光表達正常，細胞病變明顯，證實病毒包裝成功，經檢測其滴度為1.871010pfuml。結論：結論：攜帶報告基因的腎癌組織特異性復制缺陷型5型腺病毒構建成功，重組后的病毒Ad5CAIXE1AIREShrGFP1，為外周