CD39+FoxP3+調節(jié)性T細胞(Treg)與乙肝慢加急肝衰竭(ACLF)的相關性研究.pdf

1、乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一種世界性疾病，發(fā)展中國家發(fā)病率高，據(jù)統(tǒng)計，全世界大約有2.8億人慢性感染乙型肝炎病毒，在我國就占了1.3億。每年我國大約有2千萬乙型肝炎病毒慢性感染者發(fā)病，約有40萬人死于乙肝病毒相關的肝衰竭、肝硬化以及肝癌。國家每年要花大量的醫(yī)療經(jīng)費用于乙肝患者的治療，乙肝問題已成為我國急需解決的公共衛(wèi)生問題[1]。
　　 乙肝慢加急肝衰竭(Acute on Chronic liver fail

2、ure，ACLF)是在慢性乙型肝炎的基礎上，由于多種因素作用下，肝組織破壞急性加重，大量肝組織細胞壞死，導致肝功能衰竭[2]，同時并發(fā)肝性腦病、肝腎綜合征、消化道出血、感染等嚴重并發(fā)癥，病死率極高。目前研究表明慢加急肝衰竭發(fā)病機制可能與HBV病毒復制、宿主免疫反應以及感染等多種因素有關，但確切機制尚待進一步研究。近年來，臨床研究提示患者體內免疫功能失調可能是造成慢加急肝衰竭肝組織嚴重損傷的機制之一[3]。
　　 調節(jié)性T細胞(R

3、egulatory T cells，Treg)是一類具有免疫調節(jié)功能的T細細胞群，其特征性標記物為CD4+CD25+FoxP3+，具有免疫低反應性和免疫抑制性兩大功能特征[4]。研究已證實Treg的數(shù)量及功能改變與很多疾病如自身免疫性疾病、腫瘤及感染性疾病等密切相關[5-12]。最近研究發(fā)現(xiàn)CD39+FoxP3+Treg細胞可能是Treg中發(fā)揮免疫調節(jié)功能的主要細胞群。CD39是細胞外三磷酸腺苷(ATP)水解酶家族成員之一，其作用在于水

4、解細胞外的三磷酸腺苷/二磷酸腺苷( ATP/ADP)。ATP是細胞損傷的指示劑，細胞內的ATP濃度很高，細胞損傷后，細胞內大量的ATP釋放到細胞外，ATP被嘌呤P2受體識別后誘發(fā)主要的炎癥前反應。CD39通過滅活ATP，抑制由ATP誘發(fā)的炎癥反應[13]。目前研究發(fā)現(xiàn)CD39主要表達于FxoP3+Treg細胞膜外，并且其在Treg細胞的免疫調節(jié)功能中發(fā)揮非常重要的作用。國外研究證實，CD39+FoxP3+Treg細胞免疫抑制功能顯著強于

5、CD39-FoxP3+Treg細胞，并且和多種疾病的發(fā)病和進展密切相關?，F(xiàn)已證實，不同疾病進程的多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)患者外周血中Treg細胞數(shù)量與健康人差異不大，但兩者間CD39在Treg細胞胞外的表達比例存在顯著差異，MS復發(fā)的患者外周血中FoxP3+Treg細胞CD39的表達比例明顯低于處于穩(wěn)定狀態(tài)的MS患者以及健康人[14]。
　　 HBV慢性感染的特點是其病毒特異性免疫反應微弱，目前認

6、為乙型肝炎的慢性活動狀態(tài)與異常的免疫耐受有關，但免疫耐受的機制目前尚不清楚。Treg細胞可以抑制效應T細胞的功能，近年的研究發(fā)現(xiàn)Treg細胞在抗HBV特異性免疫反應損傷中發(fā)揮著重要的作用。但CD39+Treg細胞是否參與了乙肝慢加急肝衰竭的發(fā)病過程目前在國內、外還未見報道。
　　 為了進一步認識CD39+Treg細胞與乙肝慢加急肝衰竭的發(fā)病關系，我們首先對健康人外周血CD39+Treg細胞的表型及功能特點進行分析，比較了乙肝慢加

7、急肝衰竭患者與健康人外周血CD39+Treg細胞的變化情況，對比乙肝慢加急肝衰竭存活組和死亡組外周血CD39+Treg細胞占外周血單個核細胞比例的差異，通過功能試驗驗證了CD39+Treg細胞的抑制功能。本研究具體的研究內容及結果有以下幾個方面。
　　 一健康人外周血CD39+FoxP3 +Treg細胞的表型鑒定
　　 為了探討CD39+Treg細胞與乙肝慢加急肝衰竭的關系，我們首先檢測了健康人外周血的Treg細胞表型，

8、FACS結果顯示以CD39作為標志物，可以將FoxP3+Treg細胞分成CD39+FoxP3+Treg和CD39 - FoxP3+Treg兩群細胞，CTLA-4、HLA-DR、CD45RO、Ki-67等表面標記物在CD39+FoxP3+Treg細胞的表達明顯高于CD39-FoxP3+Treg細胞。上述結果為我們下一步的功能試驗奠定了基礎。
　　 二健康人外周血CD39+FoxP3+Treg細胞的功能分析
　　 Treg細

9、胞的鑒定除了表型外，更重要的是體內或體外環(huán)境下是否發(fā)揮抑制功能。本部分分別對CD39+FoxP3+Treg和CD39-Fxop3+Treg細胞抑制PBMC增殖和IFN-γ,分泌的能力進行了檢測。結果顯示表達CD39的FoxP3+Treg細胞抑制細胞增殖功能明顯強于不表達CD39的FoxP3+Treg細胞，且明顯抑制外周血單個核細胞IFN-γ的分泌。
　　 三健康人和乙肝慢加急肝衰竭患者外周血中CD39+FoxP3+Treg細胞的

10、變化比較
　　 為了明確CD39+FoxP3+Treg細胞與乙肝慢加急肝衰竭發(fā)病是否密切相關，我們比較健康人和乙肝慢加急肝衰竭患者外周血中CD39+FoxP3+Treg細胞比例的情況，對比乙肝慢加急肝衰竭存活組和死亡組外周血CD39+Treg細胞占外周血單個核細胞比例的差異。結果顯示，乙肝慢加急肝衰竭患者外周血中CD39+FoxP3+Treg細胞比例明顯高于健康人，乙肝慢加急肝衰竭存活組外周血CD39+FoxP3+Treg細胞占