miR-214及CREB1在胃癌發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的作用及分子機制研究.pdf

1、胃癌是我國及世界上最常見的惡性腫瘤之一，胃癌患者的預后較差。浸潤轉(zhuǎn)移是胃癌的一個重要特征，常導致患者預后不良。揭示胃癌浸潤轉(zhuǎn)移的分子機制是胃癌基礎和臨床研究的重要課題。
　　除了基因?qū)W的改變以外，非編碼RNA特別是microRNA(miRNA，miR)，對腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。miRNA是一類內(nèi)生性的、長度約19-25個核苷酸的小RNA，主要是通過與靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'-UTR）結(jié)合，降解靶

2、mRNA或抑制靶蛋白的翻譯，廣泛參與增殖、凋亡、發(fā)育、分化等多種生物學過程，在人類疾病包括腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。而目前尚未見miR-214在胃癌中的詳細研究。
　　本研究擬在人胃癌組織及細胞系中檢測miR-214的表達情況，進行miR-214功能學實驗以探究其生物學作用，并鑒定其調(diào)控的靶基因。預測軟件提示cAMPresponsive element binding protein1（CREB1，cAMP反應元件結(jié)合蛋白）

3、可能是miR-214的一個靶基因，本課題擬初步探究CREB1在胃癌中的表達、功能及分子機制，以期為胃癌的診斷和治療提供新的方法和靶點。
　　第一部分胃癌中miR-214表達的臨床意義及其對胃癌細胞生物學行為的影響
　　研究目的:
　　1.檢測miR-214在胃癌組織及細胞中的表達情況。
　　2.分析miR-214與臨床病理參數(shù)及患者預后的關系。
　　3.探究miR-214對胃癌細胞浸潤轉(zhuǎn)移及增殖、凋亡的影響

4、。
　　4.鑒定miR-214直接調(diào)控的靶基因。
　　研究方法:
　　1.使用實時定量PCR檢測80例胃癌組織和18例非腫瘤胃黏膜組織及4種胃癌細胞株（MKN28、BGC823、MKN45及SGC7901）、1種非腫瘤的永生化細胞株GES-1中miR-214的表達情況。
　　2.收集患者臨床資料及隨訪信息，分析miR-214與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)的關系。Kaplan-Meier法及Log-rank檢

5、驗分析miR-214的預后價值。
　　3.胃癌細胞轉(zhuǎn)染LV3-hsa-miR-214（過表達）、miR-214 inhibitor（抑制劑）及Negative control（陰性對照）后，進行細胞遷移浸潤和增殖、凋亡實驗來驗證其生物學功能。
　　4.使用TargetScan軟件預測miR-214的靶基因，通過熒光素酶檢測和Western blot實驗，驗證miR-214調(diào)控的直接靶基因。
　　結(jié)果:
　　1.8

6、0例胃癌組織中miR-214的表達水平較18例非腫瘤胃黏膜組織下調(diào)約6倍，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中下調(diào)更明顯。同時，4種胃癌細胞中miR-214的表達水平較非腫瘤胃粘膜組織也呈現(xiàn)不同程度的下調(diào)。
　　2.miR-214的表達與腫瘤直徑及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負相關。然而生存分析顯示miR-214對患者的預后無明顯影響。
　　3.miR-214可抑制胃癌細胞的增殖、遷移浸潤能力，而對細胞凋亡無明顯作用。
　　4.靶基因軟件Tar

7、getScan預測提示FGFR1、CSF1、NOTCH2、CREB1、AGAP2等是miR-214的潛在靶基因。熒光素酶實驗和Western blot證實CSF1是miR-214的直接靶基因。
　　結(jié)論及意義:
　　miR-214在胃癌組織和多種胃癌細胞系中表達下調(diào)，在轉(zhuǎn)移性的胃癌組織中降低更明顯。miR-214可抑制胃癌細胞的增殖、遷移浸潤能力，而對細胞凋亡無明顯影響。CSF1是miR-214的直接靶基因。miR-214對

8、其它靶基因（如CREB1等）的調(diào)控作用有待進一步驗證。miR-214可下調(diào)CSF1的表達，miR-214可能通過調(diào)控CSF1發(fā)揮了抑制胃癌細胞增殖、遷移浸潤的作用。
　　第二部分胃癌中CREB1的表達、預后價值及miRNA對其的調(diào)控作用
　　研究目的:
　　1.檢測CREB1在胃癌組織中的表達情況。
　　2.分析CREB1在胃癌中的臨床意義及預后價值。
　　3.驗證CREB1是否受到miR-214等miRN

9、A的調(diào)節(jié)。
　　研究方法:
　　1.免疫組化檢測185例原發(fā)灶胃癌組織、50例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶胃癌組織、50例非腫瘤胃粘膜組織中CREB1蛋白的表達情況。
　　2.使用卡方檢驗分析CREB1表達與臨床病理參數(shù)的關系。Kaplan-Meier法及Log-rank檢驗分析CREB1表達與病人預后的關系。
　　3.使用miRWalk、starBase軟件預測可能調(diào)控CREB1的miRNA，通過熒光素酶實驗、Western

10、blot驗證miRNA對CREB1的調(diào)控作用。
　　結(jié)果:
　　1.CREB1在非腫瘤胃粘膜組織、胃癌原發(fā)灶、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中呈遞增式表達。CREB1表達水平在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織相比于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織中明顯升高。
　　2.CREB1的高表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、腫瘤分期正相關。
　　3.CREB1高表達的患者的總生存時間和無瘤生存時間明顯短于CREB1低表達的患者。CREB1與腫瘤分期聯(lián)合構(gòu)建的模型，是一個獨立

11、的預后因子。
　　4.CREB1是miR-27b和miR-200b的直接靶基因，受到miR-27b和miR-200b的負向調(diào)控。
　　結(jié)論及意義:
　　CREB1的高表達與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期和患者預后不良相關。miR-27b和miR-200b可負向調(diào)節(jié)CREB1的表達。CREB1是一個有價值的生物標記物，對胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病人預后有重要提示作用。miR-27b/200b-CREB1信號通路可能為胃癌的治療提供新的

12、靶點。
　　第三部分 CREB1在胃癌中的功能及作用機制初探
　　研究目的:
　　1.探究CREB1在胃癌中的生物學功能。
　　2.鑒定轉(zhuǎn)錄因子CREB1的下游靶基因，初步探討CREB1的作用機制。
　　研究方法:
　　1.在胃癌細胞中過表達CREB1或干擾CREB1的表達，檢測其對細胞增殖、遷移浸潤能力的影響。
　　2.在胃癌細胞中，利用染色質(zhì)免疫共沉淀測序(Chromatin immunop

13、recipitationsequencing，ChIP-seq)分析轉(zhuǎn)錄因子CREB1在全基因組的結(jié)合譜，篩選CREB1可能調(diào)控的mRNA、miRNA、lncRNA。
　　3.在細胞轉(zhuǎn)染CREB1過表達質(zhì)?；駽REB1干擾RNA之后，使用實時定量PCR檢測CREB1下游候選lncRNA的表達水平。
　　4.使用ChIP-qPCR（染色質(zhì)免疫共沉淀-實時定量PCR）證實CREB1與lncRNA啟動子的結(jié)合。
　　結(jié)果:<

14、br>　　1.過表達CREB1能夠促進胃癌細胞的增殖、遷移浸潤;反之，下調(diào)CREB1表達則抑制胃癌細胞的增殖、遷移浸潤。
　　2.ChIP-seq結(jié)果提示CREB1可以結(jié)合到831個mRNA、276個lncRNA、62個miRNA的啟動子區(qū)。
　　3.ChIP-seq的結(jié)果與本課題組前期做的胃癌轉(zhuǎn)移相關lncRNA芯片取交集，將候選lncRNA范圍縮減為9個。
　　4.通過實時定量PCR驗證，發(fā)現(xiàn)CREB1可正向調(diào)節(jié)l