顆粒裂解抗菌結(jié)構(gòu)域在大腸桿菌中的重組表達.pdf

1、近年來，伴隨著細菌耐藥性問題的日趨嚴峻，對新型抗感染藥物的需求十分迫切，因此尋找傳統(tǒng)抗生素的替代品顯得越來越重要?？咕氖且活愑缮矬w產(chǎn)生的具有抗菌活性的小分子多肽的總稱。自其發(fā)現(xiàn)以來，人們已經(jīng)相繼獲得了上千種具有不同抗菌活性的抗菌肽及其類似物。它們作為一類新型的抗菌物質(zhì)，廣泛分布于從低等生物到高等動植物的各種生物體中，越來越多的研究表明抗菌肽在宿主天然性免疫中發(fā)揮著重要的作用。與傳統(tǒng)抗生素相比，抗菌肽獨特的抗菌機理使其有望發(fā)展成為一種

2、新型的抗菌藥物，其潛在的應用價值也已經(jīng)受到人們的普遍關注。
　　 顆粒裂解肽（Granulysin）與NK-lysin分別是人源性和豬源性的細胞毒性T淋巴細胞（CTL）以及自然殺傷細胞（NK）內(nèi)含有的陽離子型抗菌肽，都是脂結(jié)合蛋白SAPLIP (saposin-like protein)家族成員之一。兩者序列結(jié)構(gòu)相似度為67％，空間結(jié)構(gòu)均由五個α-螺旋（H1-H5結(jié)構(gòu)域）經(jīng)loop連接而成，且都具有抗菌活性。G13結(jié)構(gòu)域是Gra

3、nulysin中由19個氨基酸殘基組成的一個肽段，可抑制真菌和細菌的活性，但對脂質(zhì)體和動物細胞沒有毒性。NKLF-2結(jié)構(gòu)域是NK-lysin中由22個氨基酸殘基構(gòu)成的肽段，對結(jié)核分枝桿菌有直接的細胞毒性，且不會引起溶血反應。
　　 本研究主要采用兩種不同策略分別探討G13與NKLF-2結(jié)構(gòu)域在大腸桿菌中的表達。一種是通過設計共表達策略來抑制目標陽離子抗菌肽對宿主菌的毒性作用，以實現(xiàn)抗菌結(jié)構(gòu)域在大腸桿菌中的高效表達。該方法主要是通

4、過將一段編碼陰離子配體的DNA序列與陽離子抗菌肽基因分別設計插入到pACYCDuet-1載體的兩個多克隆位點中。構(gòu)建的共表達型重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞后，經(jīng)IPTG誘導共表達。結(jié)果證明該方法可有效提高陽離子抗菌肽的表達產(chǎn)量。從而為抗菌肽的深入研究和開發(fā)經(jīng)濟有效的生產(chǎn)方法奠定基礎。
　　 另外一種提高抗菌肽原核表達效率的策略是，在不改變目標抗菌肽氨基酸序列的前提下，根據(jù)需要對mRNA翻譯起始區(qū)（TIR）核苷酸序列進行優(yōu)化突變