子宮內(nèi)膜相關芯片的通路富集分析及其在豬繁殖機理研究中的應用.pdf

1、繁殖性能對于養(yǎng)豬業(yè)而言,直接關乎生產(chǎn)成本,進而影響經(jīng)濟效益,意義重大。很多因素都會影響到豬繁殖性能。其中子宮內(nèi)膜作為雌性生殖器官的一部分,是維持生理特征和生育功能的重要器官。子宮內(nèi)膜具有高度增殖活性,然而它又極易受流產(chǎn)、感染、內(nèi)分泌等多種因素的影響,導致子宮內(nèi)膜的再生能力下降,容受性降低,嚴重影響繁殖力。基因芯片是后基因組學時代基因功能分析的重要技術之,已廣泛地應用于人類疾病和模式生物復雜性狀遺傳機制的研究。南于基因芯片的成本高,微陣列

2、的制備、樣品的準備與標記比較繁瑣,分析系統(tǒng)價格昂貴,信號的假陽性率高等,使得該技術的普及與推廣存在一定的難度。而且基因芯片的分析及注釋需要較完備的基因組序列信息,使之在豬等家畜中的應用受到極大的限制,許多研究者只能應用低密度微陣列或跨物種基因芯片進行相關研究。在豬等農(nóng)業(yè)動物的研究方面,雖然應用基因芯片已檢測出許多與重要經(jīng)濟性狀、疾病等相關的基因,但就這些基因在豬的生長發(fā)育過程和疾病發(fā)生發(fā)展中所擔任的角色、相互作用機制仍未完全明確。因此對

3、豬的遺傳育種,可以從比較基因組學的角度出發(fā),利用人及小鼠等模式生物的全基因組信息,對其進行服務。
　　 對子宮內(nèi)膜相關疾病和異常的全基因組研究,在人及牛等其它物種上,積累了不少數(shù)據(jù),而且注釋信息完整。因此,我們可以通過對已有的人、牛相關芯片數(shù)據(jù)進行分析整合,再通過比較基因組學的辦法進行同源基因比對,以期得到影響豬子宮內(nèi)膜的關鍵通路和候選基因。為進一步研究影響豬繁殖性能的分子遺傳機制和分子標記輔助選擇育種奠定基礎。
　　

4、本論文的研究工作主要包括以下內(nèi)容:
　　 1.子宮內(nèi)膜異位癥芯片數(shù)據(jù)的通路富集分析及整合
　　 首先將從公共數(shù)據(jù)庫中收集到的相關數(shù)據(jù),采用統(tǒng)一的預處理方法進行處理,然后應用基因集富集分析方法對子宮內(nèi)膜異位癥相關的微陣列數(shù)據(jù)進行分析,最后對每套的結(jié)果進行整合分析。結(jié)果表明,在卵巢型的3套數(shù)據(jù)集中,發(fā)現(xiàn)17個共同上調(diào)的通路和23個共同下調(diào)的通路。在腹膜型的2套數(shù)據(jù)中,有26個上調(diào)通路是一致的,有1個下調(diào)通路是一致的。比較這兩

5、種類型的分析結(jié)果,發(fā)現(xiàn)有13個相同的上調(diào)通路和1個相同的下調(diào)通路。這些通路主要與免疫疾病和免疫系統(tǒng)相關。對子宮周期的數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明,分泌早期有12個顯著上調(diào)通路和18個顯著下調(diào)通路,分泌中期沒有顯著上調(diào)通路,只有29個顯著下調(diào)通路。對3個時期得到的通路進行比較,發(fā)現(xiàn)彼此之間交集很少。對以子宮內(nèi)膜內(nèi)皮細胞為樣本的數(shù)據(jù)進行基因集富集分析,得到46個顯著上調(diào)通路和1個顯著下調(diào)通路。將其與以上結(jié)果比較,得到2個共同通路。通過GSEA方法得到的

6、上述結(jié)果更容易解釋也更可靠,提高了微陣列實驗結(jié)果的可重復性,為后續(xù)實驗驗證指出了方向,并為在分子水平上研究豬繁殖機理提供了參考通路和基因。
　　 2.能量負平衡對子宮內(nèi)膜相關通路及基因的影響
　　 研究日糧能量水平對母豬子宮內(nèi)膜的影響,對于合理飼養(yǎng)育成期母豬以及提高繁殖率和經(jīng)濟效益,都具有重要的意義。本研究利用GEO數(shù)據(jù)庫中奶牛能量負平衡的微陣列表達數(shù)據(jù),采用基因集富集分析的方法,篩選能量負平衡時,子宮內(nèi)膜顯著差異表達的

7、相關通路和基因,。分析得到23個顯著上調(diào)通路和26個顯著下調(diào)通路。上調(diào)通路中,大部分是免疫系統(tǒng)和免疫性疾病相關通路。其中,Toll樣受體信號通路、T細胞受體信號通路等7個通路是免疫系統(tǒng)相關通路,而原發(fā)性免疫缺陷、自身免疫性甲狀腺疾病等5個通路與免疫性疾病相關。顯著下調(diào)的通路中,主要是代謝相關通路、氧化磷酸化通路和細胞周期通路等。
　　 免疫性疾病相關通路,神經(jīng)退行性疾病相關通路和生物合成相關通路最多。分別將這三類通路包括的基因進

8、行比較,得到了相關的三個核心基因列表。與免疫性疾病相關的核心基因是BOLA,BOLA-DMA,BOLA-DMB,BOLA-DQA1,BOLA-DQA2,BOLA-DQA5,BOLA-DQB,BOLA-DRA,BOLA-DRB3,CD80,CD86,FAS,GZMB,LOC12672,LOC525727和PRF1;與神經(jīng)退行性疾病相關的基因列表為ATP5F1,ATP5G1,ATP5G3,COX7A2,CYC1,NDUFA5。NDUFB2,

9、NDUFB5,NDUFB7,NDUFC1,NDUFS6,NDUFS8,NDUFV1和UOCRB；與生物合成相關通路相關的核心基因列表為ALDOC,CS,DLD,IDH1,MDH2,PDHA1,PFKM,和PKM2。
　　 3.影響豬子宮內(nèi)膜的候選通路及基因篩選
　　 通過分析疾病和能量對子宮內(nèi)膜的影響,我們發(fā)現(xiàn)了很多共同的通路和基因。這些共同的通路可以作為研究豬子宮內(nèi)膜的候選通路,而共同的基因,可以映射到豬的染色體上,作

10、為影響豬子宮內(nèi)膜的重要基因。我們將人卵巢型子宮內(nèi)膜異位癥芯片數(shù)據(jù)和能量負平衡數(shù)據(jù)的分析結(jié)果相比,發(fā)現(xiàn)相同的上調(diào)通路有12個和下調(diào)通路有10個。這22個通路可作為影響豬子宮內(nèi)膜的候選通路,其中包含的同源基因是我們重點關注的基因。此外,PPAR信號通路僅在一套數(shù)據(jù)中小顯著,也作為候選通路納入結(jié)果中,共得到23個候選通路。對每個通路包括的基因進行提取,合并,去重復,共得到212個人Entrez基因。將這212個人的Entrez基因通過BioM

11、art數(shù)據(jù)庫,在豬染色體上尋找對應的同源基因,并對應到相應的染色體位置上。有比對結(jié)果的Entrez基因有168個,其中122個人Entrez基因?qū)?40個豬Unigene同源基因,其它Entrez基因沒有找到對應的豬unigene同源基因,但得到了相應同源基因在豬染色體上對應的起始位置。
　　 4.豬胚胎和子宮內(nèi)膜發(fā)育相關內(nèi)參基因的篩選
　　 胚胎發(fā)育到胎膜與子宮內(nèi)膜附著是一個漸進的過程。人們對這一過程進行了很多研究,

12、實時定量PCR因其快速可靠的特點已經(jīng)成為分析基因轉(zhuǎn)錄水平的常用手段,通常使用看家基因進行相對定量。然而很多看家基因隨著環(huán)境的改變其表達也會發(fā)生變化。而微陣列芯片數(shù)據(jù)包含了整個基因組的信息,可以供我們篩選在特定組織中穩(wěn)定表達的基因,將其作為內(nèi)參基因進行相對定量。我們應用元分析辦法整合多套關于豬胚胎和子宮內(nèi)膜發(fā)育的芯片數(shù)據(jù),初步篩選出表達穩(wěn)定的前100個候選內(nèi)參皋因,大部分為編碼核糖體蛋白的基因。
　　 綜上所述,本文通過對人和牛相

13、關芯片數(shù)據(jù)的分析,發(fā)現(xiàn)在疾病和能量差異情況下,在子宮內(nèi)膜顯著差異表達的相關通路和基因,并采用比較基因組學的方法,將所發(fā)現(xiàn)的相同通路和基因,映射到豬染色體上,并對應得到豬的同源皋因。這些通路和基因可作為影響豬子宮內(nèi)膜的候選通路和基因,不僅可以對現(xiàn)有繁殖相關基因有更深入的了解,還有助于發(fā)現(xiàn)新的與繁殖性狀相關的重要候選基因,為母豬繁殖性狀標記輔助選擇(MAS)和標記輔助導入(MAI)提供新的依據(jù)。最后,利用GEO數(shù)據(jù)庫中與豬胚胎發(fā)育和子宮內(nèi)膜