ROCK對PDGF誘導大鼠血管乎滑肌細胞MMP-2、MMP-9及MEF2A表達的初探.pdf

1、目的:
　　 動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是嚴重威脅人類健康的常見病和多發(fā)病。血管平滑肌細胞(Vascularsmoothmusclecell，VSMC)的表型轉化、增殖、遷移是動脈粥樣硬化發(fā)病的關鍵因素。血小板源性生長因子(Platelet-derivedgrowthfactor，PDGF)是一種較強的促有絲分裂劑和化學趨化劑，在正常動脈中無表達，當血管受損深達中膜時，其被大量分泌，釋放入血，與其受體結

2、合，促進平滑肌細胞由中層向內層的遷移。Rho激酶(Rhoassociatedkinase，ROCK)屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，參與調節(jié)細胞的多種行為與功能，如細胞遷移，細胞增殖，細胞粘附，細胞骨架重組以及其他炎癥反應等。ROCK有兩種亞型，ROCKⅠ和ROCKⅡ。本實驗室前期研究顯示:ROCKⅠ在血管平滑機細胞的遷移中起主導作用，而ROCKⅡ對遷移影響不明顯。伴隨著血管平滑肌細胞的增殖和遷移，有大量的細胞因子表達。其中，基質金屬蛋

3、白酶(Matrixmetalloproteinases，MMPs)是一組鋅離子依賴的內肽酶，由VSMC、巨噬細胞及其他一些細胞產生，可降解細胞外基質(extracellularmatrix，ECM)，為血管平滑肌細胞的遷移掃清道路。肌細胞增強因子2A(myocyteenhancer-bindingfactor2，MEF2A)是一類DNA結合蛋白，有調控VSMCs表型轉化，調控VSMC增殖的作用。本文旨在研究PDGF刺激下，ROCKⅠ/R

4、OCKⅡ對大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞(A7r5)中MMP-2、MMP-9和MEF2A表達的影響，及ROCKⅠ和ROCKⅡ兩種亞型之間的功能差異，進一步探討血管平滑肌細胞增殖及遷移的分子機制。為研究動脈粥樣硬化的發(fā)病機制及診斷預防提供新的思路，相關分子信號機制的研究為藥物尋找靶點奠定理論基礎。
　　 方法:
　　 (1)利用明膠酶譜法檢測PDGF對大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞(A7r5)、人動脈血管平滑肌細胞(Aos)、豚鼠

5、腦基底動脈血管平滑肌細胞(Gba)、兔血管平滑肌細胞(SM3)中MMP-2、MMP-9活性的影響;(2)用10ng/mlPDGF刺激VSMC3h、6h、12h、24h后分別提取RNA，利用RT-PCR檢測MMP-2、MMP-9及MEF2A在mRNA水平的表達;(3)采用RNA干擾技術，分別使ROCKⅠ/ROCKⅡ表達下調以及同時下調ROCKⅠ/ROCKⅡ，利用RT-PCR、WesternBlot檢測基因下調后細胞內MMP-9和MEF2A

6、在mRNA水平和蛋白水平表達的變化。利用ROCK抑制劑Y-27632檢測MMP-9和MEF2A的表達;(4)構建ROCKⅠ、ROCKⅡ過表達質粒，載體為pMD19-TSimpleVector，穩(wěn)定轉染，利用RT-PCR檢測基因過表達后細胞內MMP-2、MMP-9和MEF2A在mRNA水平表達的變化。
　　 結果:
　　 (1)明膠酶譜結果顯示，在大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞(A7r5)、人動脈血管平滑肌細胞(Aos)、豚鼠

7、腦基底動脈血管平滑肌細胞(Gba)中，10ng/mlPDGF刺激后MMP-2活性明顯增強，而兔血管平滑肌細胞(SM3)中不明顯。(2)RT-RCR結果表明PDGF促進血管平滑肌細胞(A7r5)中MMP-2、MMP-9及MEF2A的表達，且呈現(xiàn)時間效應關系，在12小時時達到峰值。(3)siRNA轉染后，ROCKⅠ和ROCKⅡ表達明顯下調，其中ROCKⅠ表達下調了77.3％，ROCKⅡ表達下調了91.7％;在siRNA瞬時轉染和抑制劑Y-2

8、7632作用下，ROCKⅠ和ROCKⅡ均抑制了PDGF誘導的MMP-9和MEF2A的表達，兩種亞型對MMP-9的作用無明顯差別，而ROCKⅡ對MEF2A的抑制作用相對顯著。(4)穩(wěn)定轉染ROCKⅠ/ROCKⅡ過表達質粒;上調ROCKⅠ/ROCKⅡ基因表達后，ROCKⅠ/ROCKⅡ均促進MMP-2、MMP-9和MEF2A的表達，兩種亞型之間無明顯差別。
　　 結論:
　　 (1)ROCKⅠ和ROCKⅡ對PDGF誘導的血管平