呼吸道合胞病毒感染單核細胞調控CD4+T細胞亞群增殖的研究.pdf

1、呼吸道合胞病毒(RSV)是嬰幼兒下呼吸道疾病最重要的病原，可導致包括肺炎和支氣管炎在內的嚴重的呼吸道疾病。在全球，每年會造成6，400萬例感染病例和16萬例死亡病例。由于RSV致病機理不清，目前對于RSV感染尚無有效的疫苗或特異性抗病毒藥物，因此迫切需要對其致病機理進行深入研究。
　　研究表明，免疫調控在RSV致病中具有重要的作用，主要表現為CD4+T細胞的免疫反應失衡，但其具體機理尚不清楚。單核細胞是機體防御系統(tǒng)的重要組成部分，

2、在機體損傷治愈、抗御病毒入侵和對疾病的免疫方面起著重要的作用。但是單核細胞在RSV致病機理中的作用并不清楚，特別是其與RSV感染導致的機體CD4+T細胞免疫反應紊亂的關系尚未有文獻報道。
　　為觀察RSV能否通過感染單核細胞調控CD4+T細胞亞群的增殖，用RSV感染單核細胞，感染后的單核細胞與CD4+T細胞共培養(yǎng)7天后，收獲細胞檢測增殖的CD4+T細胞中Th1、Th2、Th17和Treg亞群的比例。實驗結果顯示，RSV感染的單核細

3、胞可降低Treg的比例，增加Th2的比例，但對Th1和Th17的比例無顯著影響。研究結果提示，RSV感染的單核細胞可以調控CD4+T細胞亞群的增殖。
　　單核細胞可以分為CD16+和CD16-兩個亞群，為闡明介導RSV調控作用的具體單核細胞亞群，通過流式細胞分選儀將單核細胞分選為CD16+和CD16-兩個亞群。采用相同滴度的RSV分別感染CD16+和CD16-單核細胞，結果顯示RSV感染CD16+單核細胞的效率更高。將RSV感染的

4、CD16+和CD16-單核細胞分別與CD4+T細胞共培養(yǎng)一周后，檢測RSV感染的兩種單核細胞亞群對CD4+T細胞亞群增殖的影響。結果顯示RSV感染的CD16+單核細胞可以顯著降低Treg細胞比例，同時增加Th2細胞比例。而RSV感染的CD16-單核細胞無明顯調控作用。該結果表明RSV可通過感染CD16+單核細胞調控CD4+T細胞亞群的增殖。
　　為初步研究RSV感染后CD16+單核細胞調控CD4+T細胞亞群增殖的機理，將RSV感染

5、的CD16+單核細胞與CD4+T細胞共孵育，同時在培養(yǎng)基中加入多種細胞因子（IL-1β、IL-6、IL-10、IL-13、IL-27和TNF-α）的中和抗體及其對照抗體，來觀察CD4+T細胞中Treg以及Th2的比例變化。實驗結果顯示，中和IL-10后，RSV感染的CD16+單核細胞對Treg的抑制作用減弱，同時檢測了單核細胞和CD4+T細胞共培養(yǎng)體系上清中多種細胞因子的濃度，結果顯示在加有RSV感染的CD16+單核細胞的實驗組中，IL

6、-10的水平顯著上升，提示IL-10可能介導了RSV對Treg的抑制作用;中和IL-1β和TNF-α后，RSV感染的CD16+單核細胞對Th2的促進作用減弱，提示IL-1β和TNF-α可能介導了RSV對Th2的促進作用。
　　為了進一步研究RSV病毒蛋白在上述免疫調控中的作用，設計了一條創(chuàng)新性的技術路線快速構建了多種可誘導性表達RSV蛋白的細胞系。將不同的RSV病毒蛋白基因分別克隆到含有PiggyBac轉座子位點的Cumate誘導

7、表達載體上，與PiggyBac轉座酶質粒共轉染HEK293細胞，利用嘌呤霉素進行篩選，并用Cumate誘導病毒蛋白表達。流式細胞儀及Western blot檢測結果均表明，加入誘導劑Cumate后，篩選的細胞系中開始表達相應的病毒蛋白，提示細胞系構建成功。從而證明了利用PiggyBac轉座子可以高效率的構建誘導性表達RSV病毒蛋白的細胞系。該項工作為研究RSV病毒蛋白在上述免疫調控中的作用打下了基礎。
　　綜上所述，發(fā)現RSV能夠