基于金屬編碼探針的多元腫瘤標志物早期篩查免疫傳感器研究.pdf

1、本論文是基于金屬編碼探針、生物夾心免疫及電化學溶出技術構建了一系列簡單、快速、靈敏、低成本的多元電化學免疫分析方法，用于同時檢測多種腫瘤標志物（甲胎蛋白 AFP、癌胚抗原CEA、糖類抗原CA19-9）。多元電化學免疫分析方法是在單元檢測基礎上發(fā)展起來的一種新的分析方法，本文依據不同金屬的溶出峰電位不同，來區(qū)別定義腫瘤標志物，對應的溶出峰電流來定量腫瘤標志物，達到單次運行同時測定多種腫瘤標志物的目的。構建的免疫分析方法使用免疫磁珠Dyna

2、beads、磁性分子印跡MMIPs作為捕獲探針，不僅簡化了分離步驟，還增加了待測物的富集量；使用高聚物Envision、石墨烯（G）、聚賴氨酸（PLL）作為載體，進一步負載金屬編碼標簽（量子點QDs、納米金Au、重組脫鐵鐵蛋白r-Apo及脫鐵鐵蛋白Apo）分別制備可分辨的信號標簽。當抗原抗體之間發(fā)生特異性免疫反應后，隨即形成夾心免疫復合物。磁性分離后，執(zhí)行高靈敏度的溶出伏安技術，在同一體系同時定量分析金屬元素，以定量多種腫瘤標志物的含量

3、。
　　本論文的研究工作從以下三個方面展開：
　　1.基于聚合物-金屬信號放大標簽和雙向溶出伏安法的多元電化學免疫分析方法
　　本章構建了一個雙向溶出伏安免疫分析方法，同時檢測多種腫瘤標志物甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）、糖類抗原CA19-9。我們采用Envision負載金屬納米粒子作為信號探針，免疫磁珠作為捕獲探針。Envision，一種長鏈聚合物，含有大量的辣根過氧化物酶和二抗。我們將其作為載體，標記相應的

4、一抗，并負載納米CdS、PbS、Au制備可分辨的信號探針。我們在磁珠Dynabeads上同時固定三種一抗，制備捕獲探針。通過夾心型免疫反應，形成免疫復合物。進一步使用雙向溶出伏安法，定量分析金屬成分Cd、Pb、Au以檢測三種腫瘤標志物。AFP、CEA、CA19-9檢測范圍分別為1 pg mL1-50 ng mL1，1 pg mL1-50 ng mL1，5 pg mL1-100 ng mL?1；檢測限分別為0.02 pg mL1，0.05

5、 pg mL?1，0.3 pg mL?1。實驗結果表明構建的雙向多元免疫分析可同時檢測多種標志物，具有靈敏度高、穩(wěn)定性良好等優(yōu)點，并在臨床免疫學方面擁有一定的應用前景。
　　2.基于重組脫鐵鐵蛋白編碼的金屬標簽構建多元電化學免疫方法
　　本章構建了一種多元電化學免疫分析方法，同時測定兩種腫瘤標志物，采用AFP和CEA作為研究模型。我們使用重組脫鐵鐵蛋白編碼的金屬納米粒子（rApo-M）作為信號標簽，雙模板磁性分子印跡（MMI

6、Ps）作為捕獲探針。我們在石墨烯（G）上原位合成納米金（Au）制備G-Au納米復合物，以負載重組脫鐵鐵蛋白（rApo-M）及標記一抗（anti-AFP和anti-CEA）制備信號探針。弱堿性溶液中加入模板蛋白AFP和CEA，多巴胺（DA）在納米Fe3O4表面形成MMIPs以制備捕獲探針。夾心型免疫反應后，信號探針固定到MMIPs表面。隨后使用電化學溶出技術，分析檢測金屬成分Cd和Pb，量化腫瘤標志物。實驗結果表明，同時測定AFP和CEA

7、線性范圍為0.001-5ng mL-1。AFP和CEA的檢出限分別為0.3和0.35pg mL-1（S/N=3）。此外，結果表明我們構建的多元電化學免疫分析可拓展為其他生物標志物的臨床篩查。
　　3.基于生物基聚合物納米探針構建多元電化學免疫方法
　　本章構建了一種新穎的夾心型電化學多元免疫方式，同時檢測雙分析物AFP和CEA。將甲胎蛋白和癌胚抗原的一抗包被磁珠作為捕獲探針。金屬編碼的脫鐵鐵蛋白(Cd-Apo和Pb-Apo)

8、及二抗分別通過納米金(AuNPs)交聯(lián)在聚賴氨酸(PLL)上，通過自組裝制備成信號探針。經過夾心免疫反應，在磁珠上形成夾心免疫復合物。我們通過鉛(Cd)和鎘(Pb)的溶出電位不同來區(qū)別待測物。兩者的溶出峰電流分別與AFP和CEA的濃度相關。實驗結果表明構建的免疫策略實現(xiàn)了對AFP和CEA的同時檢測，線性范圍都為0.01-50 ng mL-1，檢測限為4 pg mL-1。該方法簡單、靈敏且環(huán)保。此外該方法成功應用于同時檢測血清樣品中的AF