ABL SH3-T79Y突變體聯(lián)合伊馬替尼對CML細胞增殖和凋亡的影響及機制研究.pdf

1、慢性粒細胞白血病的特征性融合蛋白BCR-ABL通過其SH3結構域與RIN1蛋白高特異性低親合力結合，導致酪氨酸激酶活性持續(xù)活化，促進疾病發(fā)生發(fā)展。課題組前期通過計算機藥物設計技術獲得ABLSH3突變體SH3-T79Y，通過其與RIN1蛋白相互作用并聯(lián)合伊馬替尼（Imatinib，IM），可在體外有效抑制慢粒細胞株K562及KCL22細胞增殖、促進凋亡。
　　本課題擬檢測 SH3-T79Y聯(lián)合IM作用于慢粒耐藥細胞株K562/G01

2、引起的增殖、凋亡效應改變，并分析其發(fā)生作用的機制；構建小鼠皮下瘤和血液瘤模型，進一步探討SH3-T79Y聯(lián)合IM對KCL22細胞在動物體內的增殖能力和致病性的影響。采用的實驗方法如下：
　　1.Western Blot檢測不同濃度的IM對K562/G01細胞p-BCR-ABL蛋白的影響，篩選聯(lián)合用藥的IM濃度；SH3-T79Y與IM聯(lián)合處理細胞后，采用克隆形成實驗和流式細胞術檢測細胞周期分析細胞增殖，瑞氏染色觀察細胞形態(tài)學變化、流

3、式細胞術檢測細胞凋亡率分析細胞凋亡效應。
　　2.SH3-T79Y聯(lián)合IM用藥處理K562/G01細胞后，Western Blot檢測p-BCR-ABL/BCR-ABL、p-CrkL/CrkL、p-Stat5/Stat5、p-Akt/Akt、MEK、p-Erk/Erk、Bcl-2、Bax、c-Myc、Cyclin-D1、Caspase-8、BID和 Caspase-3蛋白表達水平的變化，分析聯(lián)合用藥作用機制。
　　3.SH3

4、-T79Y聯(lián)合 IM處理 KCL22細胞后，經皮下注射于Balb/c裸鼠構建皮下實體瘤模型，經尾靜脈注射于NOD-SCID小鼠構建慢性粒細胞白血病移植瘤模型，以IM單獨處理和經PBS處理的KCL22細胞為對照組。通過比較小鼠一般情況，計算皮下瘤成瘤率，瑞氏染色監(jiān)測血液瘤模型鼠骨髓和外周血象變化，HE染色觀察肝、脾組織腫瘤細胞浸潤情況，PCR檢測其骨髓細胞bcr-abl基因表達水平，繪制生存曲線，探討聯(lián)合用藥對KCL22細胞在實驗動物體內

5、增殖能力和致病性的影響。
　　通過以上實驗，獲得如下結果和結論：
　　1.K562/G01細胞對IM耐藥，聯(lián)合用藥IM濃度選擇為3μM。SH3-T79Y聯(lián)合IM作用使K562/G01細胞克隆形成率明顯降低，細胞周期阻滯在S期；瑞氏染色見凋亡小體、核聚集、核碎裂等典型凋亡現(xiàn)象，細胞凋亡率顯著增加。
　　結果證實：SH3-T79Y聯(lián)合IM可在體外有效抑制K562/G01細胞增殖、促進凋亡。
　　2 SH3-T79Y聯(lián)

6、合IM可明顯抑制K562/G01細胞BCR-ABL、CrkL磷酸化水平；抑制下游信號通路p-Stat5/Stat5、p-Akt、MEK、p-Erk/Erk蛋白表達；抑制凋亡相關蛋白 Bcl-2、c-Myc，增加 Bax；抑制周期蛋白Cyclin-D1；同時可促進Caspase-8、Caspase-3活化，對BID沒有明顯影響。
　　結果證實：SH3-T79Y聯(lián)合IM用藥影響K562/G01細胞增殖和凋亡的機制與調節(jié)BCR-ABL底

7、物水平、影響下游信號通路相關蛋白及凋亡相關蛋白等有關。
　　3.Balb/c裸鼠皮下瘤模型中PBS對照組、IM單獨處理組、聯(lián)合用藥組成瘤率分別為100％、33.3%、16.7%。NOD-SCID小鼠CML移植瘤模型中，PBS對照組于注射細胞后約4周開始逐漸出現(xiàn)反應力下降、精神萎靡、股骨肌腫大、后肢骨節(jié)出血點等體征，外周血白細胞從第5周逐漸增多，計數(shù)顯著升高，血涂片可見幼稚粒細胞，肝、脾組織切片及骨髓涂片可見白血病細胞浸潤，骨髓細胞