脲基類肽氨肽酶N抑制劑的設計、合成及其抗腫瘤活性研究.pdf

1、第一部分氨肽酶N的研究背景
　　 氨肽酶N(Aminopeptidase N，APN，CD13)是鋅離子依賴性金屬蛋白酶M1家族的一種膜結合型外肽酶，以同源二聚體的形式跨膜結合于細胞表面。腫瘤細胞生物學研究表明，氨肽酶N高表達于多種惡性腫瘤細胞，通過其蛋白水解酶功能，在惡性腫瘤的侵襲、轉移和血管生成等過程中通過降解細胞間基質，對腫瘤的增殖和侵襲轉移起著促進的作用。研究證明，APN在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用包括：(1)降解細胞間基

2、質，直接促進腫瘤細胞的侵襲與轉移；(2)降解細胞間基質，因而造成多種生長因子的釋放，促進腫瘤細胞增殖；(3)刺激與血管生成相關的細胞因子的釋放，促進腫瘤血管內皮細胞管狀結構的形成。
　　 血管生成是一個非常復雜的過程，僅發(fā)生于新生兒、成人愈傷時期或惡性腫瘤。當原發(fā)或繼發(fā)腫瘤的體積超過1～2mm3時，必須發(fā)展新生血管提供足夠的血液供應，才能夠繼續(xù)增殖；腫瘤的轉移也往往伴隨血管生成。血管生成包括內皮細胞透過基底膜侵襲、轉移、粘附和增

3、殖等過程，并最終在腫瘤組織內形成網(wǎng)絡結構。細胞間基質的主要成分是膠原蛋白、硫酸乙酰蛋白聚糖、纖維粘連蛋白和層粘連蛋白等，通過以膠原蛋白和蛋白聚糖為基本骨架的纖維網(wǎng)狀復合物，在細胞之間相互聯(lián)系，維持細胞連接的穩(wěn)定性和襄助細胞間的信號轉導。同時，這也成為了腫瘤細胞轉移的障礙，因此降解和侵襲基底膜是腫瘤細胞轉移和新生血管生成的第一步。
　　 由于APN與腫瘤的生長、侵襲、轉移和血管生成關系密切，因此靶向于APN的藥物已成為抗腫瘤侵襲、

4、轉移和抗血管生成方面研究的熱點。從網(wǎng)狀橄欖鏈霉菌培養(yǎng)液中提取的天然產物Bestatin被發(fā)現(xiàn)能夠抑制APN的活性，其作為免疫增強劑于1987年在日本上市。至今，許多國家的學者仍在致力于研究其在高劑量下作為APN抑制劑時對腫瘤轉移和血管生成的作用，并且已經取得了一定的進展。
　　 第二部分目標化合物的合理設計與合成
　　 本研究的特色在于，運用類肽設計的原理，以脲基代替?zhèn)鹘y(tǒng)天然肽類化合物的酰胺鍵(肽鍵)作為連接基團，以非肽

5、化學基團取代天然肽類化合物的氨基酸殘基作為改良后的藥效團，連接APN天然底物中水解頻率較高的堿性或中性氨基酸殘基，構建了小分子脲基類肽化合物庫；將計算機虛擬對接與活性測試實際結果相結合，對化合物進行結構改造和優(yōu)化，包括對連接部分和側鏈進行合理設計，并實現(xiàn)定向合成。本研究中所設計的化合物，經過幾輪結構改造，得到了抑酶活性明顯提高的一類先導化合物，并對活性較好的幾個化合物在抗腫瘤轉移和抗血管生成方面進行了進一步的抗腫瘤機制研究和動物體內藥效

6、學研究。所得結果有助于日后進一步優(yōu)化APN抑制劑的骨架和藥效團，建立完整的APN抑制劑的抗腫瘤機制評價研究和體內藥效學模型。本文中所設計的化合物具有進一步開發(fā)的價值。
　　 本文在基于生物靶標的合理藥物設計的基礎上，本著結構多樣性的原則，對化合物進行了包括側鏈、取代基和連接基團在內的三個方面的結構優(yōu)化，設計了兩種合成工藝路線，完成了三個系列82個目標化合物的合成。合成方法充分體現(xiàn)了小分子類肽合成的優(yōu)勢，工藝路線切實可行，轉化率和

7、分離收率較高。
　　 本文以兩種合成方法完成了對三個系列目標化合物的合成：(一)、為了探討氨基酸側鏈和非肽取代基團部分不同取代基對活性的影響，我們采用不同的脂肪胺或芳香胺為起始原料，經三光氣轉化為異氰酸酯，然后與不同的氨基酸甲酯以脲基相連接，再將甲酯轉化為異羥肟酸，得到目標產物；(二)、為了探討不同的連接基團或氨基酸側鏈、以及鋅離子螯合基團(ZBG)對活性的影響，我們采用了以氨基酸甲酯鹽酸鹽為起始原料，經三光氣轉化為異氰酸酯，然

8、后與不同的醇或氨基酸甲酯以氨基甲酸酯或脲基相連接，再將甲酯部分保留或轉化羧酸或者為異羥肟酸，得到目標產物。對于所得的化合物結構，通過核磁共振氫譜、碳譜、高分辨質譜確證；純度經元素分析和高效液相色譜法檢測，均為95％以上。經文獻檢索證實，所合成的目標化合物為新化學實體，未見文獻報道。
　　 第三部分目標化合物的體內外生物活性評價及其抗腫瘤機制研究
　　 本文設計合成了三個系列共82個小分子類肽化合物，并對其針對豬腎來源的A

9、PN(microsomal，sigma)的抑酶活性進行了初步篩選。針對初步篩選中得到的活性優(yōu)于陽性對照bestatin(烏苯美司)的化合物，則對其抑酶活性進行了進一步的研究，包括其對高表達APN的小鼠黑色素瘤細胞B16BL6和人卵巢透明細胞癌細胞ES-2細胞表面APN酶活的抑制能力、對這兩種細胞生存能力的影響，和對同為鋅離子依賴性金屬蛋白酶和細胞間基質(ECM)水解酶的基質金屬蛋白酶MMP-2酶活性的選擇性進行了研究。以上篩選所得到對A

10、PN活性最優(yōu)、選擇性最高并且對兩種腫瘤細胞生存影響最小的化合物，則對其進行進一步的抗侵襲和抗血管生成機制研究。根據(jù)機制研究的結果，挑選最優(yōu)者進行體內抗轉移和抗血管生成藥效學研究。
　　 酶抑制活性測試顯示，ZBG的有無和螯合強度對活性的影響很大，連接部分、氨基酸側鏈和非肽基團的結構對活性也有重要的影響。78個化合物中約有一半的酶抑制活性要優(yōu)于陽性對照烏苯美司，其中十多個化合物的半數(shù)抑制濃度(IC50)低于烏苯美司一個數(shù)量級或以上

11、。這說明脲基類肽化合物作為小分子APN抑制劑具有很大的潛力。并且，活性最優(yōu)的幾個化合物對MMP-2抑制活性很低甚至沒有，說明其具有很好的靶點選擇性；對兩種腫瘤細胞的生存能力在很高的濃度幾無影響，其用MTT法所測得的半數(shù)生長抑制濃度(GI50)均大于已上市的烏苯美司，說明可能是一類非細胞毒類化合物。
　　 體外機制研究包括兩部分，抗侵襲和抗血管生成?？骨忠u研究采用的是包被Matrigel的transwell法；抗血管生成采用的則是

12、大鼠主動脈環(huán)微血管生成測試和人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)成管腔測試，也需以Matrigel為基質。Matrigel是小鼠EHS肉瘤所分泌的細胞間基質，是用于代替ECM進行多種相關的體外機制研究的商品化產品?？骨忠u測試的結果表明，脲基類肽3-11、3-19、3-36、3-34、3-40和3-45可以在對細胞遷移能力幾無影響的情況下顯著抑制惡性腫瘤細胞ES-2的侵襲，結果具有統(tǒng)計學意義。大鼠主動脈環(huán)和HUVEC成管腔測試的結果顯示，脲基

13、類肽3-11、3-19、3-36、3-40和3-45具有顯著的體外抗血管生成作用。
　　 脲基類肽化合物的體內抗轉移和抗血管生成藥效學試驗采用了兩種模型，分別為人工肺轉移模型和腫瘤引發(fā)的皮內血管生成模型。兩種模型選擇的動物為C57BL/6小黑鼠，瘤株為B16BL6小鼠黑色素瘤。體內藥效學實驗結果顯示，脲基類肽3-36、3-40和3-45可以較為顯著地抑制小鼠黑色素瘤人工肺轉移結節(jié)的形成，抑制率分別為33.5％、37.7％和50.

14、3％；脲基類肽3-36、3-40和3-45在抗血管生成模型中也能夠明顯地抑制腫瘤細胞引發(fā)的血管生成，抑制率分別為61.7％、57.5％和67.8％。
　　 體內藥效學試驗所選擇的3個化合物其在抑酶活性、體外機制研究和體內藥效學測試中的表現(xiàn)具有良好的相關性，活性均優(yōu)于陽性對照烏苯美司，表明此3個化合物具有成為抗腫瘤候選藥物的潛力。
　　 第四部分目標化合物的構效關系研究
　　 我們選擇了在抑酶活性初篩中獲得的三個代

15、表性的脲基類肽小分子APN抑制劑1-18、3-11和3-45，對它們進行虛擬對接研究，以期考察其與靶點的結合模式，指導下一步的化合物設計和修飾改造。虛擬對接以E.coli的APN(eAPN)的晶體結構作為受體，在還原晶體復合物結構中Bestatin的構象后，則以該對接條件對這三個化合物進行對接。對接發(fā)現(xiàn)，化合物1-18和3-11均采取了與Bestatin相似的結合模式，而化合物3-45的萘基部分則延伸向了不同的方向。我們推測，這可能成為

16、化合物1-18和3-11具有較好的抑酶活性、以及抑酶活性在化合物3-45上出現(xiàn)突破的原因。
　　 第五部分結論
　　 本課題所設計的脲基類肽小分子APN抑制劑具有很好的APN抑酶活性。我們在體外機制研究和體內藥效學研究方面主要集中于APN作為腫瘤細胞表面標記物和降解ECM的金屬蛋白酶所發(fā)揮的生理和病理功能，即腫瘤轉移和腫瘤引發(fā)的血管生成，建模成功并且取得了顯著的抗腫瘤結果。體內外研究結果顯示，脲基類肽化合物具有作為先導物