利用腺相關病毒標記特定環(huán)路神經(jīng)元及其細胞核的分離與DNA甲基化研究.pdf

1、大腦作為人體最為復雜、精密的器官，由數(shù)百億個神經(jīng)元構成。單個神經(jīng)元通過突觸結構與其他神經(jīng)元連接并形成具有功能的神經(jīng)網(wǎng)絡，從而賦予動物個體意識與行為?；诮M織樣本投入的傳統(tǒng)建庫測序技術會掩蓋神經(jīng)元彼此間存在的異質性，不適用于單神經(jīng)元研究，同時，不同神經(jīng)元的形態(tài)、功能以及基因表達存在的差異性由表觀遺傳因素所決定。因此研究提出了一種對單神經(jīng)元示蹤標記及其細胞核分離的研究方法，并選取表觀遺傳的重要形式——DNA甲基化作為研究對象。
　　在

2、對重組腺相關病毒(rAAV)的構建工作中，本課題首先構建了表達目的核膜蛋白的腺相關病毒重組載體pAAV-CMV/hSyn-SUN1-GFP-antibody tag，分別用廣譜啟動子CMV和神經(jīng)元特異性啟動子hSyn在細胞系轉染實驗體外表達和鼠腦神經(jīng)元活體表達表達目的核膜蛋白。構建載體被轉染進HEK-293T細胞以進行驗證，轉染后的細胞通過熒光顯微鏡觀察，可見熒光信號呈圓形分布、邊緣更加明亮，說明目的核膜蛋白如預期實現(xiàn)核膜定位標記。但通

3、過病毒鼠腦注射實驗對所包裝重組病毒載體進行驗證，未能在腦切片上觀察到熒光信號。由于可能存在因啟動子差異或是實驗操作因素造成陰性結果的可能，本研究也構建包裝了腺相關病毒重組載體rAAV-hSyn-eGFP-NLS，并對其進行活體注射，在腦切片可觀察到大量被熒光標記的神經(jīng)元，成功實現(xiàn)對海馬投射內(nèi)嗅皮層神經(jīng)元的逆向標記，從而排除上述可能性。
　　在分離被標記細胞核的研究過程中，本課題通過細胞轉染的方式模擬被重組病毒標記的神經(jīng)元。研究過程

4、中，首先對轉染后的細胞進行勻漿處理及密度梯度離心，以分離細胞核。分離到的細胞核形態(tài)完整且雜質較少。之后通過免疫共沉淀的方式對被標記細胞核細胞核進行捕獲，所捕獲細胞核陽性率約為70％，捕獲率在65％～85％。同時對照組陰性細胞核漂洗后的殘留率僅為0.18％，因此可認為實驗組中陰性細胞核已基本漂洗干凈，該實驗方法可己滿足后續(xù)研究需求。
　　在利用單細胞進行DNA甲基化測序建庫的研究過程中，本課題參照單細胞亞硫酸鹽測序(scBS-seq

5、)的方法，先后分別以寡量細胞及單個神經(jīng)元作為建庫投入，成功獲得DNA甲基化測序建庫。所建文庫經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，文庫片段分布大小與預期相符(300bp～500bp)，同時條帶明亮，滿足上機測序要求。同時對測試樣本的測序結果進行生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)文庫測序質量較好，且組間因建庫操作造成的差異較小，因此認為該方法具有較好的可重復性。
　　針對本課題所遇到AAV載體裝載容量受限的問題，本文最后還對如何現(xiàn)有提高AAV裝載容量的研究進行論