博爾納病病毒核蛋白調控神經干細胞存活、增殖及分化的初步研究.pdf

1、背景與目的:
　　 神經干細胞(Neural Stem Cells,NSCs)在體外培養(yǎng)體系中以神經球的方式生長增殖,而在干細胞研究中,許多實驗方法都是針對單個細胞進行的。將NSCs安全有效地單細胞化是實驗中的必要步驟?，F有多種離散神經球的方法,但在安全性或有效性方面存在各種缺陷,對實驗過程造成困擾。本實驗探討一種離散神經球的安全有效的方法,為后繼實驗奠定基礎。
　　 方法:
　　 1、體外分離、培養(yǎng)新生24h內

2、的Sprague-Dawley(SD)大鼠海馬源性NSCs并進行NSCs的Nestin鑒定。
　　 2、實驗設立以下4組(1)胰酶消化組:未控制神經球體積,離散時胰酶消化30min;(2)單純吹打組:未控制神經球體積,離散時僅用巴斯德吸管吹打;(3)濾網研磨組:未控制神經球體積,離散時采用不銹鋼濾網研磨;(4)控制神經球體積結合胰酶短時消化組:對神經球體積加以控制,離散時胰酶短時消化。
　　 3、分別在離散后5min及離

3、散后1d,觀察各組神經球單細胞化效果及NSCs生長情況。
　　 4、分別在離散后5min及離散后1d,對各組細胞進行臺盼藍染色細胞計數,計算細胞存活率。
　　 結果:
　　 胰酶消化較長時間(＞30min)可以得到大量單細胞但是難以存活;單純巴斯德吸管吹打離散神經球效果差;不銹鋼濾網研磨對細胞損傷大,導致細胞存活率低下;而采用控制神經球體積結合胰酶短時消化可以獲得大量單細胞并且細胞存活率明顯較高(離散后5min9

4、2.2％和離散后1d82.0%,p＜0.05)。
　　 結論:
　　 控制神經球體積(直徑約50μm左右)結合胰酶短時(約5min左右)消化法是離散神經球的一種安全有效的方法。
　　 背景與目的:
　　 博爾納病病毒((Borna Disease Virus,BDV)是一種具有高度嗜神經性的病毒。近年,有大量研究發(fā)現該病毒感染與人類神經精神疾病包括抑郁癥的發(fā)生有關。但其確切機制仍未明了。核蛋白是BDV的主

5、要蛋白之一,由p40基因片段編碼,在細胞中含量最豐富、變異程度最小。一些研究顯示ERK1/2信號通路在NSCs的存活、增殖和分化中發(fā)揮重要作用。本實驗用含有博爾納病病毒核蛋白(BDV p40)基因的真核表達質粒pEGFP-p40轉染新生24h內SD大鼠海馬源性NSCs,觀察其增殖、存活及分化的改變,以及對NSCs ERK1/2信號通路的影響,試圖了解BDV p40對NSCs的作用,從而揭示BDV引起神經精神疾病的部分發(fā)病機制。
　

6、　 方法:
　　 1、用陽離子脂質體法將pEGFP-N1-p40及pEGFP-N1質粒分別轉染到NSCs中,在熒光顯微鏡下觀察轉染效率,用RT-PCR鑒定BDV p40在NSCs中的表達,
　　 2、實驗設置3組:未轉染組、pEGFP-N1空轉組及pEGFP-N1-p40轉染組,用CCK-8試劑盒檢測細胞存活的改變,用BrdU攝入實驗檢測細胞增殖的改變,并經免疫組化檢測轉染后14d細胞貼壁分化為神經元、星型膠質細胞、少

7、突膠質細胞的比例變化。用Western Blot檢測ERK1/2磷酸化的改變。
　　 結果
　　 1、成功建立表達BDV p40的NSCs模型。在熒光顯微鏡下觀察到pEGFP-N1空轉組和pEGFP-N1-p40轉染組約10%NSCs在胞漿和/或胞核可見綠色熒光,未轉染組無綠色熒光表達;PCR結果顯示只有pEGFP-N1-p40轉染組細胞有BDV p40基因表達,而pEGFP-N1對照組及未轉染組細胞內均未見表達。

8、>　　 2、(1)BDV p40抑制NSC S的存活。(2)BDV p40抑制NSCs的增殖。(3)在轉染后貼壁分化14d時3組細胞分化為神經元、星型膠質細胞、少突膠質細胞的比例未見顯著差異。(4)Western Blot結果顯示BDV p40下調了磷酸化ERK1/2在蛋白水平的表達。
　　 結論:
　　 BDV p40抑制NSCs的存活、增殖,但是對NSCs的分化方向沒有明顯的影響。BDV p40有可能通過下調磷酸化