cADPR在哮喘致敏血清和細胞因子所致鼠支氣管平滑肌細胞應激時鈣反應增強中的作用.pdf

1、支氣管哮喘（簡稱哮喘）是一種病因和發(fā)病機制都十分復雜的氣道慢性炎癥性疾病，氣道炎癥和氣道高反應性是它的重要特征。支氣管平滑肌細胞作為氣道炎癥和氣道高反應性的主要效應細胞，它的鈣濃度變化影響著收縮性，細胞增殖、浸潤和細胞因子的釋放。Th2 類細胞因子白介素-5（IL-5）、白介素13（IL-13）
　　 以及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）在哮喘的發(fā)生、發(fā)展的過程中扮演著重要的角色。
　　 研究表明細胞因子和哮喘致敏血清可調

2、節(jié)氣道平滑肌細胞的鈣反應。環(huán)腺苷二磷酸核糖（cADPR），一種重要的鈣調節(jié)的第二信使，通過細胞內(nèi)鈣釋放受體雷尼丁受體（RyR）發(fā)揮著作用。FK506 結合蛋白12.6（FKBP12.6）是免疫抑制蛋白超家族的主要受體結合蛋白，具有通過結合RyR2 上的四個結合位點來穩(wěn)定該受體的作用。
　　 目的：
　　 本項目的研究是研究cADPR在哮喘致敏血清和細胞因子處理導致的鼠支氣管平滑肌細胞對刺激劑的鈣反應增強中的作用，及其作用

3、是否通過影響FKBP12.6和RyR2的的結合活性。從而探討cADPR在哮喘發(fā)病機制的作用，為臨床預防和治療哮喘提供新的思路和實驗依據(jù)。
　　 方法：
　　 1．用組織貼塊法原代培養(yǎng)鼠支氣管平滑肌細胞。
　　 2．用哮喘致敏血清和細胞因子處理鼠支氣管平滑肌細胞后，用鈣離子熒光指示劑Fura-2 標記后，采用實時鈣熒光成像技術動態(tài)監(jiān)測胞漿游離鈣濃度（[Ca2+]I）的變化。觀察哮喘致敏血清和細胞因子處理后，10μm

4、ol/L 緩激肽和10μmol/L 乙酰膽堿分別刺激引起的胞漿內(nèi)游離鈣的動態(tài)變化。以及8-Br-cADPR和3-Deaza-cADPR 依次孵育細胞后，10μmol/L 緩激肽刺激引起的胞漿內(nèi)游離鈣的動態(tài)變化。
　　 3．用熒光分光光度計來檢測哮喘致敏血清和細胞因子處理后的鼠支氣管平滑肌細胞中ADP-ribose cyclase的活性變化。
　　 4．免疫熒光染色檢測哮喘致敏血清和細胞因子處理對FKBP12.6和RyR2

5、的共定位的影響，以及用cADPR的類似物3-Deaza-cADPR 處理后的共定位變化。
　　 5．用免疫共沉淀法測定哮喘致敏血清和細胞因子處理后的鼠支氣管平滑肌細胞FKBP12.6和RyR2的結合活性的變化。
　　 結果：
　　 1．細胞的形態(tài)與“波峰---波谷”樣結構以及平滑肌肌動蛋白α的特異性表達證實所培養(yǎng)細胞為鼠支氣管平滑肌細胞。
　　 2.哮喘致敏血清和細胞因子處理后的鼠支氣管平滑肌細胞，乙酰膽

6、堿、緩激肽誘發(fā)的鈣升高的幅度都明顯高于它們的對照組。
　　 3．8-Br-cADPR和3-Deaza-cADPR 依次預先作用哮喘致敏血清和細胞因子處理后的鼠支氣管平滑肌細胞，緩激肽誘發(fā)的鈣升高的幅度也都明顯高于它們的對照組。
　　 4．哮喘致敏血清和細胞因子處理后的鼠支氣管平滑肌細胞，ADP-ribosecyclase的活性也明顯高于它們的對照組。
　　 5．細胞因子處理后的鼠支氣管平滑肌細胞FKBP12.6和

7、RyR2 共定位明顯減少。3-Deaza-cADPR 導致哮喘致敏血清和細胞因子處理后的鼠支氣管平滑肌細胞FKBP12.6和RyR2 共定位進一步減少。
　　 6．免疫共沉淀法也說明了哮喘致敏血清和細胞因子處理后的鼠支氣管平滑肌細胞FKBP12.6和RyR2 結合減少。
　　 結論：
　　 cADPR在哮喘致敏血清和細胞因子處理所致的氣道平滑肌細胞應激時鈣反應增強中發(fā)揮一定的作用，其作用可能與引起FKBP12.6