發(fā)光功能化納米材料及其在生物成像中的應用研究.pdf

1、近年來，隨著細胞生物學的不斷發(fā)展，人們對細胞內的活性物質、細胞信號傳導及細胞凋亡過程等方面的研究越來越深入?；诎l(fā)光材料開發(fā)出的可視化分析技術已經廣泛應用于細胞生物學分析。目前，用于生物成像分析的探針主要是基于有機染料分子的熒光成像，它們?yōu)榛罴毎治鎏峁┝擞行У某上駲z測手段。但有機熒光染料分子存在著熒光壽命較短、容易淬滅及發(fā)光強度不穩(wěn)定等缺點。如何設計出新型發(fā)光生物探針以提高生物成像分析的選擇性和準確性，實現長時間的實時動態(tài)監(jiān)測，是急需

2、解決的問題。隨著納米技術的發(fā)展，由于量子點熒光探針發(fā)射峰窄，光穩(wěn)定性好，在生物醫(yī)學研究中的應用潛力受到廣泛關注。但是，傳統(tǒng)的量子點多數由重金屬構成，由此帶來的潛在生物毒性限制了其在生物成像領域的進一步應用。而另一種不需要光源激發(fā)的發(fā)光技術，包含了生物發(fā)光在內的化學發(fā)光，是一個多元的化學反應體系，被廣泛的應用于體液及組織提取液中的活性物質檢測。但其不能無損的進入細胞，且多元的反應組分在生物體內的擴散速率差異也制約了化學發(fā)光技術在生物體內成

3、像上的應用。
　　為了解決上述問題，本論文基于兩種新型的納米材料，即MoS2量子點和包裹介孔二氧化硅殼層的聚離子液納米反應器，開發(fā)出了具有細胞成像分析功能的新型熒光探針和化學發(fā)光探針。
　　本論文主要包括以下四個方面的內容：
　　1、通過改進的化學剝離方法，用Na在160℃，真空條件下插入到MoS2粉末的片層中，結合超聲處理制備了具有強熒光性質的單片層MoS2量子點。應用透射電子顯微鏡、激光動態(tài)光散射粒徑儀及Zeta電

4、位儀、原子力顯微鏡、紫外可見吸收光譜、熒光分光光度計和X射線衍射儀等對所合成的MoS2量子點進行了表征。所制得的MoS2量子點粒徑約為3.5nm，表面電荷為-20.2 mV，具有良好的水溶性，且熒光穩(wěn)定性好的特點。通過MTT法檢測了MoS2量子點的細胞毒性。發(fā)現MoS2量子點的生物相容性好的優(yōu)點。通過毛細管電泳儀分析MoS2量子點和含巰基氨基酸的相互作用，結果表明MoS2量子點可以和含巰基的化合物共價結合。通過熒光顯微鏡考察了MoS2量

5、子點對細胞的標記。結果表明MoS2量子點能順利穿透細胞膜進入細胞內，且能通過與細胞內巰基化合物的作用長時間的保留在細胞中，能對細胞進行長時間的熒光成像。MoS2量子點為長時間活細胞熒光成像示蹤分析和研究細胞的微結構提供了有效的研究方法和手段。
　　2、由于 MoS2量子點具有尺寸小、生物相容性好、易于被巰基修飾的優(yōu)點。我們通過表面修飾的方法在MoS2量子點表面修飾上兩種具有pH響應的熒光配體（LA-Flu和LA-RhB）。進而開發(fā)

6、出了pH檢測范圍更廣的pH響應比率熒光探針（dl-MoS2）。LA-Flu在酸性條件下熒光強度降低，堿性條件下熒光強度升高。而LA-RhB在酸性條件下熒光強度增加，在堿性條件下熒光強度降低。通過兩個配體熒光強度的比值可以反映出細胞內的pH值。與單一波長響應的pH熒光探針相比，比率熒光探針有效排除了探針濃度因素帶來的誤差。大多數具有pH響應的單波長熒光探針，對 pH響應的范圍限制在探針 pKa±1的范圍內。dl-MoS2通過兩個不同pKa

7、值的pH響應熒光配體的熒光比率隨pH的變化，使dl-MoS2在整個細胞內pH范圍內（pH=4-8）具有線性響應。同時可以通過MoS2量子點表面的配體比，有針對性的調節(jié)dl-MoS2對pH的響應范圍。
　　3、在MoS2量子點表面修飾上線粒體靶向基團三苯基膦和pH響應的LA-RhB配體，開發(fā)出了線粒體靶向pH響應比率熒光探針（mito-MoS2）。mito-MoS2中MoS2量子點的熒光強度不隨pH變化而變化，在比率熒光探針中作為熒

8、光參照。細胞器共定位實驗顯示：mito-MoS2在線粒體上共定位的皮爾森相關系數為0.856，而在溶酶體上共定位的皮爾森相關系數僅為0.259。這些結果表明mito-MoS2能靶向的在線粒體內富集。通過雙激發(fā)雙發(fā)射熒光檢測模式，利用 mito-MoS2檢測了 Hela細胞線粒體的pH值，并對Hela細胞在氧化應激狀態(tài)下線粒體pH變化進行了成像檢測，結果表明mito-MoS2探針可以對線粒體內的pH進行實時成像檢測，并且能夠可視化的檢測線

9、粒體的酸化過程。
　　4、利用包裹介孔二氧化硅的聚離子液納米反應器，開發(fā)出了具有核殼結構的過氧化氫化學發(fā)光生物探針（c-PIL@SiO2）。聚離子液核具有特殊的親疏水性，由親水的帶電離子液部分和疏水的長烷烴鏈部分組成。其中疏水區(qū)用于裝載過氧化草酸酯和熒光染料。親水區(qū)則為生物質環(huán)境中的過氧化氫提供了進入納米反應器核芯的通道。外層的介孔二氧化硅殼層為該化學發(fā)光探針提供了必要的機械穩(wěn)定性并維持其在生物體系中的分散性。c-PIL@SiO2

10、粒徑在100 nm左右，激光共聚焦細胞成像結果表明c-PIL@SiO2能在5 min內順利進入RAW264.7細胞。而過氧化草酸酯和熒光染料裝載進納米反應器后，化學發(fā)光動力學發(fā)生了改變，化學發(fā)光時間得以延長。這些特點使得在c-PIL@SiO2無損地進入細胞后，能夠順利地檢測到雙氧水的化學發(fā)光信號。我們進一步利用c-PIL@SiO2，通過小動物成像系統(tǒng)對小鼠的關節(jié)炎模型進行檢測，實現了該納米反應器在細胞和活體層面上的化學發(fā)光成像。PIL@