香煙煙霧抑制Nrf2誘導人肺動脈內皮細胞衰老在肺血管重塑中的作用.pdf

1、慢性阻塞性肺部疾病（COPD）的致病原因有很多，但是吸煙在其中占主導地位，COPD患者最嚴重的并發(fā)癥是肺動脈高壓（PH），PH常常會導致右心衰竭。肺動脈高壓最常引起形態(tài)學改變就是因平滑肌細胞增殖而導致肺血管結構重塑（PVR），目前PVR的形成機制并不清楚。已知吸煙會刺激細胞產生活性氧族（ROS）并誘導細胞發(fā)生衰老以及端粒長度的縮短[1,2]，衰老的細胞會分泌衰老相關分泌表型（SASP），SASP中的炎性細胞因子和一些細胞生長因子可誘導肺

2、動脈平滑肌細胞的遷移和增殖。因此，肺血管內皮細胞是一種重要的衰老相關的效應細胞，容易在接觸血液的過程中受到血流剪切力和氧化應激的刺激產生內源性的ROS，而且能夠分泌多種相關細胞因子，因此在由吸煙引起的血管老化的微環(huán)境中起著關鍵的作用。核呼吸相關因子2（Nrf2）是一種抗氧化和抗衰老的重要DNA結合蛋白，可以調控下游多種抗氧化相關基因的表達直接或間接地對抗氧化應激。Nrf2/ARE途徑是目前發(fā)現(xiàn)的對抗ROS最重要的信號通路[3]。有研究表

3、明，長期吸煙的COPD患者中Nrf2的表達水平較低，而且此類患者中外周血白細胞的端粒長度較未吸煙的COPD患者明顯縮短，提示COPD是一種典型的衰老過程，Nrf2在COPD發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。目前，關于吸煙對于影響Nrf2的表達及其在PVR中的作用研究較少。
　　第一部分香煙煙霧刺激可以誘導肺動脈內皮細胞DNA損傷以及衰老。
　　目的：探究延長香煙煙霧提取物（Cigarette Smoke Extract CSE）刺激的

4、時間對肺動脈內皮細胞（HPAEC）的影響。
　　方法：細胞培養(yǎng)后，香煙煙霧提取物（Cigarette Smoke Extract CSE）刺激不同的時間點，利用流式細胞術觀察細胞周期、免疫熒光檢測細胞衰老相關蛋白P21、Real-time PCR檢測p53和p21基因、flow-fish的方法檢測細胞端粒的長度、β-半乳糖苷酶染色檢測細胞衰老情況。結果香煙煙霧刺激72h后與對照組（0h）相比，細胞周期阻滯明顯（p<0.01）；隨著

5、時間的延長，細胞的端粒長度逐漸縮短(P<0.05)；Real-time PCR結果顯示衰老相關標記物p53和p21的表達逐漸升高，提示細胞衰老逐漸加重。結論延長香煙煙霧刺激時間加速肺動脈內皮細胞的衰老和DNA的損傷。
　　第二部分 Nrf2在香煙煙霧誘導HPAEC發(fā)生衰老過程中的作用。
　　目的：探究香煙煙霧刺激引起HPAEC產生的影響其內在機制以及與nrf2的表達的關系。
　　方法：研究提示隨著CSE對HPAEC的刺

6、激，Nrf2表達量是先升高后下降的，12小時時表達量最高，72h時表達量降到最低。為了探討cse刺激和Nrf2表達的關系，分別采取了三種干預措施，觀察作用效果。第一，在刺激12小時對細胞進行siNrf2的轉染，再聯(lián)合CSE刺激觀察細胞的衰老效應；第二，構建Nrf2的質粒并進行轉染，轉染之后利用CSE刺激細胞，觀察72h后相關基因的表達量；第三，利用Nrf2的激活劑tBHQ觀察激活Nrf2之后對CSE誘導的細胞衰老的變化。利用wester

7、n blot和Real-time PCR的方法檢測Nrf2及其相關基因DJ-1和下游基因HO-1和NQO1以及衰老相關基因p53、p21的表達量、利用β—半乳糖苷酶染色檢測細胞衰老。
　　結果：
　?。?）對細胞進行轉染siNrf2之后，細胞的抗氧化作用下降，CSE刺激12h后，細胞相比于未轉染的細胞衰老明顯，p53和p21的表達升高。
　?。?）細胞轉染Nrf2的質粒后，給予CSE刺激72h發(fā)現(xiàn)，細胞的抗氧化作用明顯

8、提高，衰老相關基因和蛋白的表達量較低。
　?。?）Nrf2的激活劑tBHQ作用后，給予CSE刺激72h，細胞抗氧化作用同樣提高，效應與質粒轉染相同。
　　結論：Nrf2在吸煙引起的細胞衰老中具有重要作用，短時間的CSE刺激可以激活Nrf2增強細胞的抗氧化作用，但是隨著刺激時間的延長Nrf2的表達下降，細胞逐漸趨于衰老狀態(tài)。
　　第三部分衰老的HPAEC分泌SASP可誘導肺動脈平滑肌細胞的增殖，促進PVR的形成
　

9、　目的：觀察HPAEC在接受CSE刺激衰老后分泌的衰老相關分泌表型(SASP)是否會誘導肺動脈平滑肌細胞的增殖。
　　方法：運用ELISA方法檢測了時間梯度影響下的HPAEC的分泌物TNF-α、TGFβ1、MCP-1、IL-6、bFGF的濃度，隨著時間的延長SASP的濃度逐漸升高。通過Real-time PCR的方法檢測衰老相關分泌表型基因在HPAEC中的表達，制備條件培養(yǎng)基對肺動脈平滑肌細胞進行培養(yǎng)觀察，利用CCK8法檢測細胞的

10、增殖，Transwell實驗方法檢測遷移能力，通過流式細胞術和ki-67蛋白的表達兩種方法確定HPASMC的增殖與HPAEC細胞中Nrf2的表達之間的關系。結果：隨著時間的延長，bFGF、IL-6、IL-8、MCP-1、TNF-α、TGF-β1的表達量升高，24h之內有下降的趨勢，48h、72h表達量升高明顯（p<0.01）；CCK8檢測發(fā)現(xiàn)，細胞在條件培養(yǎng)基的刺激下，CSE刺激時間越長的培養(yǎng)基，細胞增殖越明顯；條件培養(yǎng)基中72h和48