家蠶Smox基因的克隆及在TGF-β-Smads信號通路中的功能研究.pdf

1、轉化生長因子-β(Transforming growth factor-β; TGF-β)是一類多功能的細胞因子，對細胞的增殖、分化、胞外基質的形成、胚胎發(fā)育、骨的形成和重建具有重要的作用。由于TGF-β作用的多功能性和廣泛性，從1981年Robert發(fā)現TGF-β以來，對它的研究就沿著不同的方向展開，但對其信號傳導的通路一直不清楚。直到近年來發(fā)現了細胞內信號轉導蛋白Smad家族，才開始深入地研究TGF-β信號從膜到核轉運的分子機理。<

2、br>　　 為了研究家蠶生理功能與TGF-β-Smads信號轉導通路的關系，本論文對家蠶TGF-β-Smads信號轉導通路中一些重要功能基因進行了解析。BmSmox基因是家蠶TGF-β-Smads信號轉導通路中的一個關鍵功能基因，相當于哺乳動物Smad2/3的直系同源物。利用EST分析、PCR技術等從家蠶組織中克隆了BmSmox基因。為了分析BmSmox基因在家蠶TGF-β-Smads信號轉導通路中的相關功能，采用與TGF-β-Sma

3、ds信號轉導通路中Smad2/3結合并負責運輸的動力蛋白輕鏈Rob1基因作為TGF-β-Smads信號轉導通路的調節(jié)器，利用Rob1基因的表達變化而改變BmSmox運輸到細胞核內的狀況，分析BmSmox基因的表達影響調控靶基因表達的變化規(guī)律。利用融合PCR技術構建pBac[A3-GFP-Rob1]表達載體，通過脂質體轉染法將表達載體導入家蠶BmN細胞。用Real-time PCR技術，檢測在過表達Rob1蛋白的條件下，家蠶BmN細胞中T

4、GF-β-Smads信號通路中Smox基因和下游靶基因p21的表達化。
　　 本研究得到的實驗結果如下:
　　 1.BmSmox基因克隆及生物信息學分析。通過檢索相關數據庫、電子克隆與實驗克隆相結合，在家蠶中克隆到一個Smad直系同源基因，該基因位于2號染色體上，命名為BmSmox基因。BmSmox基因ORF框由1335bp堿基組成，編碼444個氨基酸，克隆得到片段基本包含了整個功能域區(qū)域。利用生物信息學方法解析該基因氨

5、基酸序列的結構和功能域信息:該序列編碼的蛋白的等電點為7.9，分子量為49642.7058。其中第25到135位氨基酸序列為MH1區(qū)功能域，該區(qū)域可以直接與DNA結合;第249位到355位氨基酸序列為MH2區(qū)功能域，是特異的受體磷酸化位點。用克隆到的該序列與哺乳動物同源的Smad蛋白對比分析顯示:由于羧基端MH2區(qū)有一段特異序列，即絲氨酸片段-SSxS基序，推測該基因與哺乳動物R-Smad家族類相近。同源性分析表明:家蠶BmSmox基因

6、與其他生物的Smox蛋白序列同源性都達到75％以上，說明該蛋白在生物進化過程中十分保守，研究家蠶中的BmSmox基因功能對其他生物也具有重要參考的價值。
　　 2.利用融合PCR獲取GFP-Rob1融合蛋白序列。融合蛋白序列由A3-GFP和Rob1基因連接而成，兩序列長度分別是1405bp和235bp，融合序列長度為1681bp(加酶切位點、His標簽、保護堿基等)，在A3-GFP-Rob1融合片段兩端加入SnaBⅠ和NotⅠ酶

7、切位點。酶切鑒定與測序分析表明擴增產物為目標融合蛋白A3-GFP-Rob1序列，獲得的融合蛋白序列克隆進T載體。
　　 3.pBac[A3-GFP-Rob1]表達載體構建。對上述構建的T載體重組質粒A3-GFP-Rob1用SnaBⅠ和NotⅠ進行雙酶切，產物經膠回收純化，將得到的融合片段連接到同樣雙酶切處理過的PiggyA3GFP表達載體中，構建表達載體pBac[A3-GFP-Rob1]。挑選pBac[A3-GFP-Rob1]陽

8、性克隆PCR鑒定，測序驗證表明載體構建成功。
　　 4.表達質粒轉染家蠶BmN細胞。實驗結果表明:pBac[A3-GFP-Rob1]和pBac[A3-GFP-Rob1]+helper質粒中融合蛋白GFP+Rob1表達量較高，熒光強度較強，說明Rob1基因在BmN細胞中過表達。在相同的時間內，添加helper質粒的實驗組較未添加組熒光更強?？赡苷f明了在helper的幫助下，融合蛋白被隨機插入的細胞基因組中，能隨著細胞的分裂而復制到

9、不同的細胞中，因此細胞同時分裂時，攜帶綠色熒光蛋白的細胞比例更高，所以熒光更強。
　　 5.Real-time PCR技術檢測BmSmox基因和下游靶基因P21的表達。研究結果表明:與未轉入Rob1基因的對照組相比，過表達Rob1基因，BmSmox基因表達量降低，說明Rob1基因對BmSmox基因可能具有負調控作用。P21表達量微弱降低，說明了雖然BmSmox基因表達抑制，但是其抑制下游靶基因的作用不明顯，該結果與預期存在一定差