鴨疫里氏桿菌野生型質(zhì)粒的分離、序列分析和DPP IV缺失株的構建.pdf

1、鴨疫里氏桿菌病是由鴨疫里氏桿菌(Riemerella anatipestifer,RA)引起的家鴨、鵝、火雞和多種禽類的一種以敗血性滲出為主要特征的傳染病。臨床剖檢癥狀主要表現(xiàn)為纖維素性心包炎、肝周炎或氣囊炎,部分病例出纖維素性腦膜炎、輸卵管炎或關節(jié)炎。該病給世界各國養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失。目前已報道的鴨疫里氏桿菌血清型有21種,各血清型之間交叉保護率低,使得疫苗免疫防治比較難以進行。在大多數(shù)鴨場,鴨疫里氏桿菌感染一旦發(fā)生很難徹底清除

2、,呈現(xiàn)持續(xù)性感染的狀態(tài)。因此加強RA分子生物學、致病和免疫機制的研究,對從根本上防治該病的發(fā)生具有重要的現(xiàn)實意義。
　　 本研究利用堿裂解法抽提RA臨床分離株野生型質(zhì)粒,通過酶切分析,引物延伸的方法獲得質(zhì)粒的全序列,并對其進行生物信息學分析,為質(zhì)粒改造奠定基礎。另外利用自殺性載體首次成功構建了RA-YM菌株的DPPⅣ缺失株,為進一步研究DPPⅣ在RA致病機制中的作用奠定基礎。本研究取得的結果如下:
　　 1.鴨疫里氏桿菌

3、野生型質(zhì)粒的分離、序列分析
　　 應用堿裂解方法,對鴨疫里氏桿菌臨床分離株RA-JX進行質(zhì)粒抽提,獲得了純度較高的質(zhì)粒。采用XbaⅠ限制性酶切,膠回收酶切片段,再與同樣酶切的載體pUC18連接,得到的陽性克隆送去測序,再用引物延伸的方法,測定整個質(zhì)粒的序列。分析結果顯示,RA-JX菌株中含有的質(zhì)粒大小為8048 bp。
　　 對質(zhì)粒pRA-JX進行生物信息學分析,包括質(zhì)粒全序列的ORF的搜索,ORF的同源性比較,復制子的

4、分析等。質(zhì)粒pRA-JX上存在著分別編碼Rep-3,Transposase.11,COG2378和Cas2_Ⅰ_Ⅱ_Ⅲ的主要ORF。對質(zhì)粒pRA-JX ORF之外的序列BlastN比對、分析,推測質(zhì)粒pRA-JX的復制子,包括質(zhì)粒的復制起始蛋白以及其上游的一段序列,大小為2449 bp。本試驗為進一步從分子生物學水平研究鴨疫里氏桿菌提供了技術支持。
　　 2.鴨疫里氏桿菌血清1型云夢分離株DPPⅣ缺失株的構建
　　 參照

5、鴨疫里氏桿菌血清1型云夢分離株DPPⅣ序列,從RA-YM基因組中擴增出DPPⅣ同源臂片段,在其同源臂之間插入壯觀霉素抗性基因,連接到自殺性質(zhì)粒pRE112上,構建重組自殺性質(zhì)粒pRE-LSR。重組自殺性質(zhì)粒轉化大腸桿菌X7213,以大腸桿菌X7213陽性克隆為供體菌,與受體菌RA-YM進行接合轉移,涂布壯觀霉素(Spc)抗性平板篩選出Spc抗性的接合子,并用PCR鑒定重組自殺性質(zhì)粒已經(jīng)整合到染色體中。本試驗為進一步深入研究RA的分子致病