雙親基因載體的構筑及在增強內皮細胞轉染效率方面的研究.pdf

1、目前，心腦血管疾病手術治療存在的主要問題是移植物中新生內膜增生以及再狹窄等，這些都嚴重危及患者生命。鑒于內皮細胞的一些天然優(yōu)勢，植入材料表面快速內皮化是材料在體內移植成功的關鍵。基因治療和材料表面的功能化修飾是實現(xiàn)人工血管植入材料內皮化的兩種有效方法。本論文系統(tǒng)地綜述了基因治療和多肽修飾的生物材料在促進內皮化方面取得的成果。由于內皮細胞固有的轉染效率低下，使植入材料在體內的內皮化效果大受影響。因此，有效提高內皮細胞的轉染效率對于促進人工

2、血管材料的內皮化有著最為直接的意義。鑒于陽離子基因載體的分子量和靶向活性多肽對基因的傳遞有重要影響，本論文首先探討了陽離子基因載體的分子量對內皮細胞轉染效率的影響，進而又設計了多肽修飾的新型基因載體，并用于內皮細胞的體外轉染研究。
　　第二章.為了考察陽離子基因載體的分子量對內皮細胞轉染效率的影響，本章以聚甲基丙烯酸羥乙酯(PHEMA)為載體主鏈，通過引發(fā)L-丙交酯(LA)開環(huán)聚合，得到PHEMA-PLA嵌段共聚物。不同分子量的親

3、水鏈聚乙二醇單甲醚(PEG)和聚乙烯亞胺(PEI)通過酯化和酰胺化反應連接到羧基化的PHEMA-PLA嵌段共聚物上，制備得到四種不同分子量的陽離子基因載體：PHEMA-PLA-PEG2 kDa-PEI1.8 kDa、PHEMA-PLA-PEG5 kDa-PEI1.8 kDa、PHEMA-PLA-PEG2 kDa-PEI10 kDa和PHEMA-PLA-PEG5 kDa-PEI10 kDa。進而通過溶液自組裝的方法分別構建得到四種對應的納

4、米粒：G2I1.8、G5I1.8、G2I10和G5I10。采用動態(tài)光散射技術考察了這四種納米粒載體及其與 pEGFP-ZNF580基因形成的復合物的流體力學直徑和表面zeta電位的大小。并選取EA.hy926為模型內皮細胞，考察這四種基因載體及其復合物對內皮細胞的生物學毒性及轉染活性的影響。結果表明適當?shù)靥岣哧栯x子基因載體的分子量和在載體中引入 PEG有助于提高載體復合物在內皮細胞中的轉染效率。
　　第三章.本章制備了一種REDV

5、(Arg-Glu-Asp-Val)多肽修飾的基因載體，用于負載 pEGFP-ZNF580基因，考察了靶向活性多肽修飾的載體復合物在內皮細胞中的轉染效率。通過開環(huán)聚合和接枝聚合的方法制備得到聚乙二醇單甲醚-聚(丙交酯-co-己內酯)-聚乙烯亞胺(mPEG-P(LA-co-CL)-PEI)兩親性嵌段共聚物。通過CREDVW多肽與mPEG-P(LA-co-CL)-PEI的共價鍵合反應，制備得到REDV多肽修飾的基因載體mPEG-P(LA-co

6、-CL)-PEI-REDV。并通過自組裝的方法制備得到聚合物mPEG-P(LA-co-CL)-PEI-REDV和mPEG-P(LA-co-CL)-PEI對應的納米粒載體 REDV-NP和NP。通過凝膠電泳的方法考察了兩種載體納米粒對pEGFP-ZNF580基因的包覆能力。以EA.hy926為模型內皮細胞，借助MTT實驗考察了載體基因復合物對內皮細胞生物毒性的影響，并考察了載體復合物在內皮細胞中的轉染效率。實驗結果表明，靶向活性多肽 RE

7、DV修飾的基因載體對pEGFP-ZNF580基因包覆能力強，對內皮細胞生物相容性較好，體外轉染效率比PEI25 kDa復合物高，且能有效促進內皮細胞的遷移。
　　第四章.在本章研究中，為了制備多位點連接REDV多肽修飾的基因載體，考察其在內皮細胞中遞送基因的能力，我們以PHEMA主鏈為大分子引發(fā)劑，采用開環(huán)聚合的方法將己內酯引入到PHEMA的多條臂肢中，進而通過酯化反應和酰胺化反應將PEG和小分子量的PEI與羧基化后的PCL鏈端連

8、接，制備得到兩親性的梳型基因載體 PHEMA-PCL-PEG-PEI。借助一種異雙官能團連接劑，將REDV活性多肽引入到PEI鏈端，制備得到REDV多肽功能化的兩親性基因載體(PHEMA-PCL-PEG-PEI-REDV)。再通過自組裝的方法構筑了這種聚合物納米粒，用于對 pEGFP-ZNF580基因的包載。通過動態(tài)光散射技術和凝膠成像電泳分析的方法考察了靶向載體對pEGFP-ZNF580基因包覆能力的大小。以EA.hy926細胞為模型

9、細胞，考察了靶向基因載體復合物對內皮細胞的生物毒性及在內皮細胞中的轉染效果，并對細胞中的蛋白表達含量進行測定。結果表明該 REDV多肽修飾的雙親梳型基因載體可有效包載 pEGFP-ZNF580基因，且不會對內皮細胞造成嚴重的細胞毒性，在內皮細胞中轉染效率好，相應的蛋白表達含量高。
　　實驗結果表明陽離子基因載體的分子量對內皮細胞的轉染效率有著很大的影響，且生物活性多肽修飾的載體及基因復合物可有效提高內皮細胞的體外轉染效率。本文的研