基于脫氧核酶和蛋白質-DNA相互作用的生物傳感新方法研究.pdf

1、隨著生物科學的發(fā)展以及人類日益增長的健康需求，分析化學新方法和新技術在生命科學和醫(yī)學中的應用正受到了前所未有的關注。生物傳感器是利用生物材料特異識別功能構建的分析工具或系統(tǒng)，作為分析化學發(fā)展的前沿，它已被廣泛應用于生物化學分析、臨床診斷、環(huán)境檢測、藥物篩選、軍事科學等相關分析領域。在實際應用中，生物傳感器靈敏度高、選擇性好、成本低，并能實現(xiàn)快速地、實時的連續(xù)分析。因此，發(fā)展新的生物傳感技術或方法對于進一步推動相關學科領域的深入研究具有重

2、要的科學意義。在生物傳感新方法的研究中，脫氧核酶和蛋白質-DNA相互作用的應用為構建方便的、非標記、通用的生物分析平臺提供了新的設計思路。本論文以幾種重要的生物功能蛋白、酶及生物小分子作為分析目標，聚焦于發(fā)展簡單、低成本、高靈敏度及高選擇性的生物傳感新方法。通過利用G-四聚體脫氧核酶的高效催化能力和蛋白質-DNA的特異識別作用，新方法研究獲得了預期的結果。本論文的第2-4章是基于G-四聚體脫氧核酶構建的比色分析方法，第5-6章是基于蛋白

3、質-DNA的特異識別作用構建的生物發(fā)光和電化學分析方法，具體內容如下：
　　T4多聚核苷酸激酶(PNK)在許多細胞內生化進程中起關鍵作用。在第2章中，發(fā)展了一種新的比色分析策略用于評估PNK的活性和篩選它的抑制劑，該策略利用λ核酸外切酶的高效剪切作用和G-四聚體脫氧核酶類過氧化物酶的信號擴增作用而設計。一個包含G-四聚體脫氧核酶序列的非標記發(fā)夾DNA被用于該分析。當PNK存在時，該發(fā)夾DNA的5′端羥基能被磷酸化，而磷酸化的末端能

4、被λ核酸外切酶識別并剪切。由于用于“封閉”作用的互補序列被酶切移除，G-四聚體脫氧核酶序列得以釋放。應用該策略，對PNK的活性分析能轉化為對G-四聚體脫氧核酶的定量分析?；诨パa序列的完全封閉和剪切對脫氧核酶序列的充分釋放作用，該比色方法展現(xiàn)了對PNK分析的優(yōu)異檢測能力，具備低的檢測下限（0.06 U/mL）和寬的檢測線性范圍（0.06-100 U/mL）。此外，抑制劑對PNK活性的影響也被評估。該策略有很大潛力應用于發(fā)展高通量磷酸化分

5、析和篩選相關的藥物研究中。
　　目前已有檢測煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)或其他輔酶的方法通常是復雜難處理的和靈敏度一般的。在第3章中，發(fā)展了一種新的基于脫氧核酶的可視分析策略用于檢測NAD+，該策略基于連接酶介導的對鏈置換擴增(SDA)的抑制作用而設計。當存在NAD+時，SDA反應能被抑制，由于連接后的引物不能繼續(xù)引導SDA，使得G-四聚體脫氧核酶序列不能被生成。這個結果引致能被G-四聚體脫氧核酶定量催化的有色產(chǎn)物不能形成。因

6、此,可實現(xiàn)對NAD+的可視、高靈敏度的定量分析。該策略提供了一個簡單的、高選擇性的方法，檢測限低至50 pM。同時，它能為研究輔酶和其他小分子及DNA連接酶活性的定量檢測提供了一個通用的分析平臺。
　　最近的研究對于篩選能與多聚脫氧腺苷酸[poly(dA)]特異結合的藥物顯示了巨大興趣。在第4章中，我們發(fā)展了一個簡單的比色分析策略用于檢測能與poly(dA)序列特異結合的抗腫瘤活性物質甲氧檗因，該策略基于目標誘導分裂G-四聚體DN

7、A的形成而設計。兩條包含分裂G-四聚體序列和富A序列的DNA被應用于本策略。當存在甲氧檗因時，都包含有富A序列的兩條DNA被拉近靠攏，形成了可催化有色化合物產(chǎn)生的G-四聚體脫氧核酶。該策略分析甲氧檗因的檢測線性范圍為0.033-1.667μM，檢測限為16 nM。該分析策略不僅操作簡單，成本低廉，而且是肉眼可分辨的，在藥物篩選研究中具有很好的應用潛力。
　　DNA甲基轉移酶(MTase)是一種重要生化進程的調控因子。目前已有分析D

8、NA甲基轉移酶活性的方法的通用性和靈敏度仍待改善。在第5章中，發(fā)展了一個新的生物發(fā)光分析方法用于檢測甲基轉移酶的活性，該策略基于甲基化敏感的剪切和蛋白質體外表達作用而設計。在該策略中，Dam MTase被用做檢測模型酶，MboI被用作甲基化敏感剪切的核酸外切酶。包含有熒光素酶報告基因的DNA(LR-DNA)被用于本分析。由于完全甲基化的LR-DNA能被表達成可檢測的熒光素酶，Dam MTase活性能通過檢測表達得到的熒光素酶的發(fā)光強度而

9、獲得定量。該策略對甲基轉移酶的檢測限低至0.08U/mL，檢測線性范圍寬達0.2-100U/mL。此外，該分析模型具有良好的通用性，可能延伸應用于檢測其它DNA甲基轉移酶和相應的抑制劑的篩選。
　　靈敏地檢測特異DNA序列結合蛋白對于轉錄相關疾病的診斷及相應調控機理的理解具有重要意義。在第6章中，發(fā)展了一種簡單、靈敏、特異性高的電化學分析策略用于人TATA結合蛋白（TBP）的定量檢測。在該策略設計了一個包含特異TATA盒的雙鏈DN