SELEX技術體外篩選單增李斯特菌適配子及其熒光快速檢測方法的建立.pdf

1、目的：本文采用SELEX技術，以單核細胞增生李斯特菌為靶目標，篩選得到一組擁有高親和力和高特異性的寡核苷酸適配子，并初步建立單核細胞增生李斯特菌的熒光快速檢測方法。
　　方法：
　　1.以單核細胞增生李斯特菌為靶目標，人工合成兩端為固定序列，中間含37個隨機序列，全長為80nt長度的ssDNA文庫。應用SELEX技術進行反復9輪篩選，得到一組高親和力和高特異性的適配子群。為了減少ssDNA與其他細菌的交叉結合，在第5輪用蠟樣

2、芽孢桿菌進行反篩，在第7輪用英諾克李斯特菌進行反篩。利用地高辛-抗地高辛堿性磷酸酶顯色系統(tǒng)檢測各輪篩選產(chǎn)物與單核細胞增生李斯特菌的結合率。
　　2.最后一輪的篩選產(chǎn)物進行擴增、純化，克隆、測序。應用Chromas2軟件分析適配子的測序峰圖，DNAMAN軟件對測序出來的適配子序列一級結構進行同源性分析，并用RNAStructure軟件預測序列的二級結構。
　　3.通過對適配子結合力和特異性檢測，選取最佳的一條適配子，運用熒光結

3、合機制來設計分別標記有FAM和TAMRA的兩種熒光適配子，初步建立熒光標記適配子直接檢測法（FLADA）。
　　結論：
　　1.隨著篩選輪數(shù)的增加，篩選條件越來越嚴格，最終得到一組高親和力和高特異性的適配子群，初步建立了SELEX體外篩選單核細胞增生李斯特菌適配子的技術。利用克隆技術成功的將篩選獲得的適配子進行克隆，測序，并將得到的18條序列分為A、B、C三組。A組中的15條序列的隨機區(qū)片段長度和預期片段的隨機區(qū)長度一致，B

4、組中2條序列的隨機區(qū)片段短于預期片段的隨機區(qū)長度，C組中的1條序列的隨機區(qū)片段比預期的多了一個堿基。運用DNAMAN軟件分析18條克隆適配子一級結構的同源性，除H09序列剩下的17條序列都有較高的同源性，說明經(jīng)過9輪SELEX篩選，一級結構同源的適配子得到了一定程度的富集。應用RNAStructure軟件模擬適配子的二級結構，以莖環(huán)結構為主。
　　2.利用地高辛-抗地高辛堿性磷酸酶顯色體系對適配子的結合率進行測定，從得到的18個克

5、隆適配子中選取結合率最高的E01號適配子，并將E01號適配子與多種菌種結合，進行特異性檢測，E01號適配子與目標菌單核細胞增生李斯特菌的結合力遠遠大于其他菌種，高達1.017，說明了E01號適配子的高特異性。
　　3.選擇FAM和TAMRA兩種熒光基團對E01號適配子進行標記，熒光顯微鏡下可以直接觀測到適配子與單核細胞增生李斯特菌孵育后有較強的熒光，而與蠟樣芽孢桿菌和英諾克李斯特菌結合的數(shù)量就很少。熒光標記適配子與我們目標菌的檢測