解脂耶氏酵母脂肪酶家族的研究及新型表達系統(tǒng)的構(gòu)建.pdf

1、解脂耶氏酵母是一種非常規(guī)酵母,被認為是GRAS(generally regarded as safe),其自身能利用眾多廉價底物而分泌多種具有工業(yè)應用價值的代謝物,故從二十世紀六十年代后期就開始廣泛應用于多種不同的工業(yè)領(lǐng)域。其蛋白表達系統(tǒng)具有以下優(yōu)勢:外源基因易于整合到酵母基因組、外源蛋白表達量高、所表達的蛋白質(zhì)能進行翻譯后加工、重組菌可進行高密度發(fā)酵,以及所表達蛋白質(zhì)的低糖基化等。該酵母在分類學和分子生物學上的獨特性質(zhì)及其表達系統(tǒng)的優(yōu)

2、勢使其成為最具研究價值和應用潛力的酵母之一,但其基礎性研究的欠缺和現(xiàn)有蛋白表達系統(tǒng)的不完善性阻礙了其進一步應用。解脂耶氏酵母脂肪酶家族的特異性是它的眾多獨特性質(zhì)之一,針對該家族的系統(tǒng)性研究為闡明其獨特的分類學地位奠定基礎。此外,對現(xiàn)有解脂耶氏酵母表達系統(tǒng)的改進能使其更廣泛的應用于工業(yè)化生產(chǎn)。
　　本實驗室從中國科學院微生物研究所馬延和研究員處獲贈一株解脂耶氏酵母菌株CGMCC2.1405,從其中克隆得到其脂肪酶Lip1,Lip3,

3、Lip4及Lip5的cDNA序列,將它們進行表達后分別開展了酶學性質(zhì)研究,并證實Lip1和Lip3為酯酶而非脂肪酶,修正了人們對該脂肪酶家族成員的認識。為尋找該酵母脂肪酶新基因,本文利用生物信息學分析了解脂耶氏酵母基因組中可能的脂肪酶基因,利用大腸桿菌表達系統(tǒng)構(gòu)建小型基因庫,最終采用功能篩選獲得一個脂肪酶新基因(lip9),進行表達后對其酶學性質(zhì)進行了研究。同時成功建立了基因克隆新方法。本文構(gòu)建了解脂耶氏酵母蛋白質(zhì)定位載體用于研究其脂肪

4、酶的定位,研究發(fā)現(xiàn),除Lip8為細胞壁結(jié)合脂肪酶外(Lip2之前已證實為胞外酶),其它均定位于胞內(nèi)行使某種功能。本論文還構(gòu)建了能利用蔗糖和酪氨酸酶作為篩選標記,且能直接應用于野生型解脂耶氏酵母株的兩種新型蛋白表達系統(tǒng),結(jié)果證實兩種質(zhì)粒穩(wěn)定性好,且能用于高等真核生物蛋白質(zhì)的表達。此外,上述兩種表達系統(tǒng)為消除環(huán)境污染、擴展解脂耶氏酵母在工業(yè)上的應用范圍奠定了技術(shù)基礎。本論文的主要工作及創(chuàng)新點如下:
　　(1)利用反轉(zhuǎn)錄PCR克隆了脂肪

5、酶Lip1,Lip3,Lip4,Lip5的cDNA序列,將其在畢赤酵母中成功進行了活性表達,經(jīng)Ni-NTA層析柱純化后得到單一蛋白并研究了它們的酶學性質(zhì),首次從功能上證實Lip4,Lip5為脂肪酶,Lip1,Lip3為羧酸酯酶。
　　(2)根據(jù)已經(jīng)測得的解脂耶氏酵母基因組序列,利用生物信息學的方法,預測并擴增到18個可能的脂肪酶基因序列,用SignalP3.0對其基因結(jié)構(gòu)進行分析后,在大腸桿菌表達載體 pET-28a(+)中進行誘

6、導表達,利用對硝基苯酚棕櫚酸酯篩選得到一脂肪酶新基因,為更深入驗證其脂肪酶功能并研究其酶學性質(zhì),將其克隆入畢赤酵母中表達,經(jīng)過Ni-NTA柱純化后研究表明,其偏好水解長鏈酯,具有水解橄欖油的活性,進一步證實其有脂肪酶活性,將其定名為 Lip9。同時建立了基因克隆的新方法。
　　(3)擴增得到釀酒酵母蔗糖基因suc2做為營養(yǎng)缺陷型篩選標記,構(gòu)建得到解脂耶氏酵母新的胞內(nèi)和胞外表達載體 pINA1297-a-TS和pINA1297-TS

7、,通過比較證實了同源啟動子pTEF更適合于工業(yè)應用。同時利用該表達系統(tǒng)將人源基因rho進行了成功表達。
　　(4)在構(gòu)建的新表達載體 pINA1297-a-TS的基礎上,利用增強型熒光蛋白EGFP構(gòu)建解脂耶氏酵母蛋白質(zhì)定位載體,首次對解脂耶氏酵母脂肪酶成員進行定位研究。研究表明,除Lip8外其余均定位于細胞中,Lip8結(jié)合于細胞壁上,經(jīng)緩沖液洗10次后熒光湮滅,證實Lip8是非共價結(jié)合于細胞壁。
　　(5)本文首次將編碼酪氨