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文檔簡介
1、S-腺苷蛋氨酸,又名S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine,簡稱SAM)。它是一種廣泛存在于植物、動物、微生物體內的重要生理活性物質,具有轉甲基、轉硫基、轉氨丙基等作用,參與了40多種生化反應,緊密聯(lián)系著蛋白質、核酸、神經遞質、磷脂質以及維生素的合成,而且還與多胺和谷胱甘肽的轉化密切相關。
研究表明,S-腺苷蛋氨酸對肝病、抑郁癥、關節(jié)炎、纖維性肌痛、偏頭痛等疾病具有治療作用。此外,SAM還可以治療
2、阿爾茨海默氏癥、癲癇、帕金森氏病、亞急性脊髓變性以及HIV引起的神經性并發(fā)癥等?;赟AM的重要生理功能和廣泛應用,研究大規(guī)模高產量制備SAM的關鍵工程技術成為迫切需要解決的問題。目前,SAM的生產制備方法主要有化學合成法、酶促轉化法、發(fā)酵法和全細胞催化法四種。利用重組酵母細胞在培養(yǎng)基中加入前體L-甲硫氨酸進行發(fā)酵是目前工業(yè)規(guī)模生產SAM的主要方法。
本研究首先通過在巴斯德畢赤酵母GS115中導入SAM合成酶基因sam2以
3、及敲除胱硫醚合成酶基因cbs這兩條途徑,對菌株進行改造,共得到GS115、ZJGSU1、ZJGSU2和ZJGSU3四種菌株。通過高效液相色譜分析,其搖瓶產量分別達到了0.010 g/L、0.804 g/L、0.131 g/L、1.152 g/L,為大量制備SAM奠定重要基礎。
在搖瓶水平上考察了L-甲硫氨酸、甲醇、pH值、接種量、裝液量、油酸以及PTM1這7個因素對高產菌株ZJGSU3中SAM產量的影響。在此基礎上通過2-
4、level Factorial實驗設計,確定影響SAM產量的關鍵因子為甲醇、pH值和裝液量。選取這三個因子進行Box-Behnken實驗設計,確定其產SAM的最佳條件。結果表明:當甲醇添加量為1.5%,pH為5.0,裝瓶量為30 mL/500 mL時,SAM產量可達到最高值。采用Design-expert7.0軟件進行設計和分析后,得到最佳誘導培養(yǎng)基配方為:1.00%酵母膏,2.00%蛋白胨,1.34%YNB,1.0%L-met,100
5、 mM磷酸鹽緩沖液,1.40%甲醇,0.10%油酸,0.4%PTM1以及4.00×10-5%生物素;最佳培養(yǎng)條件為:pH5.0,接種量5%,裝瓶量30 mL/500 mL。在此培養(yǎng)條件下培養(yǎng)84 h后,SAM產量達到最高值3.23 g/L,對比優(yōu)化前的1.15 g/L,增加了1.8倍;與原始菌相比,其產量增加了300多倍。最后,對重組高產菌株ZJGSU3進行上罐擴大培養(yǎng)。通過重組菌ZJGSU35 L發(fā)酵罐四個階段(預培養(yǎng)、甘油流加、碳源
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