利用代謝工程構建高產番茄紅素大腸桿菌.pdf

1、番茄紅素是迄今發(fā)現(xiàn)的各種類胡蘿卜素中抗氧化性最強的一種，可以保護細胞和組織免受自由基和單線性氧的損害，也可以增強人體的免疫反應。研究表明，番茄紅素和降低患動脈硬化癥、冠心病以及包括肺癌、膀胱癌、宮頸癌、前列腺癌和皮膚癌在內的各種癌癥的風險存在一定的聯(lián)系。因此，番茄紅素在食品和藥品等領域具有重大的商業(yè)應用價值。近年來，利用微生物發(fā)酵法生產番茄紅素成為研究熱點，特別是利用代謝工程實現(xiàn)了番茄紅素在大腸桿菌中的異源表達，并得到較高的產量。

2、>　　 本文利用代謝工程的方法構建了高產番茄紅素的大腸桿菌工程菌：主要利用基因敲除、過量表達相關的基因和選用合適的表達載體等手段來實現(xiàn)。發(fā)現(xiàn)使用0.5％乙酸鉀作為碳源發(fā)酵效果最好。
　　 從七種大腸桿菌中選擇BW25113作為基因敲除的起始菌，利用Red重組系統(tǒng)分別對gdhA、fdhF和aceE這三個基因進行敲除，獲得了4種不同基因敲除組合的重組菌株。發(fā)酵結果表明，△g△a和△g△f△a這兩種突變菌株最好。
　　 從質

3、粒pAC-LYCO4中擴增crtE、crtI、crtB和ipi基因，加上idi、dxs、rpoS基因，利用誘導型表達質粒pBAD24和構建的組成型表達質粒pACYC315以及pACYC316，總共構建了19種表達質粒。從這些質粒中發(fā)現(xiàn)pAC315-WZM4F、pAC316-WZM3R和pAC316-WZM4R這三種質粒最好。三種高產番茄紅素質粒和基因敲除菌株△g△a、△g△f△a結合后發(fā)現(xiàn)△g△a/pAC316-WZM4R為最佳組合。△

4、g△a/pAC316-WZM4R在2YT-KAc(0.5％)的發(fā)酵培養(yǎng)基中番茄紅素的產量達到12mg/gDCW以上，比起始菌BW25113/pAC-LYCO4的2～3mg/gDCW提高了大約4倍。隨后發(fā)現(xiàn)發(fā)酵培養(yǎng)基中使用國產細菌學蛋白胨比進口的胰蛋白胨效果更好?！鱣△a/pAC316-WZM4R能夠在使用國產細菌學蛋白胨的2YP-KAc(0.5％)發(fā)酵培養(yǎng)基中產14mg/gDCW以上的番茄紅素，而△g△aT5/pAC316-WZM4R則

5、能夠產15mg/gDCW以上的番茄紅素。
　　 過量表達csrB也能夠在△g△a/pAC316-WZM4R的基礎上提高番茄紅素的產量，但無法在△g△aT5/pAC316-WZM4R的基礎上提高番茄紅素產量。
　　 還利用XL1-Red致突變菌株對pAC-LYCO4質粒和易錯PCR方法對crtE、crtI、crtB進行了隨機突變，但均無法得到番茄紅素產量提高的突變子。同時將△g△a的gapA基因替換為丙酮丁醇梭菌的gapC