地衣芽孢桿菌普魯蘭酶編碼基因的克隆與表達.pdf

1、普魯蘭酶(EC.3.2.1.41)是一種能夠專一性切開支鏈淀粉分支中的α-1，6-糖菅鍵，從而剪下整個側支，形成支鏈淀粉的解支酶。它在淀粉加工工業(yè)中有著非常重要的用途，可以大規(guī)模的提高淀粉的利用率和生產效率。普魯蘭酶可以單獨使用，亦可以與其它酶配合使用，當前較成熟地應用于高葡糖漿，高麥芽糖漿和干啤酒生產中。普魯蘭酶的水解性質決定了它具有提高淀粉質原料利用率、降低糧耗的作用，因此它在淀粉加工工業(yè)中有著重要的用途和良好的市場前景。地衣芽孢桿

2、菌的全基因組序列已在2004年被公布，對基因組序列分析顯示，其中有一段大小為2133bp的片段可能編碼普魯蘭酶基因，并被標注為amyX。多年來，地衣芽孢桿菌作為外源基因表達宿主被用于包括普魯蘭酶在內的多種外源蛋白的表達，但有關地衣芽孢桿菌自身產生的普魯蘭酶及其基因則國內外均未見實驗研究報道。 本論文以PCR方法從地衣芽孢桿菌染色體DNA中擴增出amyX基因蛋白編碼區(qū)，插入大腸桿菌表達載體pET28aT7啟動子下游。經普魯蘭酶活性

3、檢測、SDS-PAGE及大腸基因組DNA的PCR擴增分析表明，普魯蘭酶基因在BL21(DE3)中得到了正確的表達。在實驗室發(fā)酵時，檢測到的酶活大約為5.6U/mL。重組工程菌連續(xù)轉接5代后，經接種培養(yǎng)、誘導發(fā)酵及PCR反應鑒定表明具有良好的遺傳穩(wěn)定性。 重組菌所產的普魯蘭酶分子量約為80kD左右；重組酶的最適作用溫度范圍為35℃～45℃，在pH6.0條件下，30℃～50℃之間酶活性變化不大；最適作用pH范圍為5.5～6.5，在溫

4、度為40℃時，有較廣泛的pH穩(wěn)定范圍，pH為5.0～7.0范圍內，該酶都具有較高的活性；該酶具有很好的熱穩(wěn)定性，40℃保溫64h仍有40％的殘余酶活。該酶反應不需要金屬離子的參與，但是很多離子如Ag+、Cu2+、Zn2+、Co2+、Mn2+、Fe2+、Cd2+和Pb2+對該酶有不同程度的抑制作用；添加Mg2+和Ca2+對酶活性有不同程度的促進作用；而添加K+、Na+、Li+、Ni2+和Ba2+對該酶無明顯的激活或抑制作用；5×10-3m

5、ol/L的SDS使酶完全失活，這可能是由于該普魯蘭酶分子中缺乏二硫橋結構的緣故。 對重組菌的發(fā)酵條件進行了初步優(yōu)化，采取了單因素試驗分別考察了不同的氮源、誘導時機、培養(yǎng)溫度、初始pH、裝液量、接種量對產酶的影響。得到了產酶的最佳培養(yǎng)基：酵母膏1％，蛋白胨1％，NaCl1％，K2HPO40.017％，MgSO4·7H2O0.012％，MnSO4·7H2O0.012％；產酶的最佳培養(yǎng)條件：培養(yǎng)3h后誘導，培養(yǎng)溫度為20℃，培養(yǎng)基的p