氯過氧化物酶發(fā)酵條件穩(wěn)定化及其高純度提取條件研究.pdf

1、海洋真菌Leptoxyphium fumago是目前用于發(fā)酵生產氯過氧化物酶(CPO)的主要菌種。在國外，CPO的發(fā)酵生產已經開展了二十多年時間。CPO是一種具有廣泛底物適應性的手性生物催化劑(Chiral Biocatalyst)，目前已經被應用于多種手性化合物合成和藥物生產的過程，可以減少反應過程中手性異構體的損失，去除藥物手性對映體的毒性，減輕廢棄物對環(huán)境的污染。但是，CPO的發(fā)酵生產過程產量不穩(wěn)定，發(fā)酵液中CPO積累濃度很低(一

2、般小于200 mg/L)，酶活力穩(wěn)定性差，高純度CPO提純過程回收率普遍較低等問題始終未能有效解決，這限制了CPO的開發(fā)與使用。
　　 本文以CPO的穩(wěn)定化生產和高純度提取為研究目標，實驗分為4個主要部分，各部分結果概述如下：
　　 1、通過實驗考察CPO發(fā)酵相關參數特征變化，分析產酶穩(wěn)定性與發(fā)酵參數變化之間的相關性，得出影響CPO生物合成阻遏效應以及酶活不穩(wěn)定性的因素。結果顯示：發(fā)酵過程中CPO產量穩(wěn)定性受多重因素的影

3、響。當發(fā)酵液pH高于6時酶活力呈快速下降趨勢，反映了pH變化與酶活力喪失存在一定的對應性；發(fā)酵溫度變化不僅能影響酶產量，而且能夠改變產酶的高峰期。數據表明在25℃條件下發(fā)酵產酶高峰最早出現(第6-7天)，且產酶量最高(180 U/ml)；接種菌體種齡在15-20 d時更有利于穩(wěn)定產酶；裝液量越小菌體進入產酶期越早。而接種量、菌絲剪切力、產酶穩(wěn)定劑的添加等對產酶穩(wěn)定性均無顯著影響。
　　 2、利用6通道補料搖床對CPO發(fā)酵過程的參

4、數進行原位在線控制。實驗表明：pH恒定在6時，產酶曲線比較平穩(wěn)。在pH回升期補加營養(yǎng)物質，pH均明顯受到控制，避免了pH的過度升高導致的酶不可逆失活，且營養(yǎng)物質的補充使得菌株產酶周期也得以有效延長。流加酸及碳、氮源基質雙因子補料發(fā)酵使得產酶穩(wěn)定化程度明顯提高，酶濃度積累最高可達364 U/ml以上。
　　 3、發(fā)酵液經過固液分離去除菌體后制備成粗酶液，再經脫色、硫酸銨鹽析、DEAE-52離子交換層析和Sephadex G-75凝

5、膠層析。CPO提純濃度達到了4594U/mg，比初始發(fā)酵液酶活提高了12.19倍，但CPO的回收率僅有9％。實驗同時還利用親水聚合物PEG6000在高離子強度下失水沉淀夾帶酶蛋白的特點，結合PEG/(NH4)2SO4雙水相萃取得到高濃度酶蛋白，再經Sephadex G-75柱層析純化得到高純度酶樣品。結果顯示：60％飽和度的(NH4)2SO4溶液可使PEG6000夾帶沉淀出總酶活95％的氯過氧化物酶，酶在PEG/(NH4)2SO4雙水相

6、系統(tǒng)中上下相分配率k可以達到0.383以下，CPO提純濃度達到2973.68 U/mg以上，回收率達到42.48％，純度提高了21.57倍，再經柱層析后酶純度略有提高，研究結果為低濃度生物活性物質的高效率提取提供了新的方法途徑。
　　 4、對CPO的固定化研究發(fā)現，采用海藻酸鈉和卡拉膠復合載體對氯過氧化物酶進行固定化后，CPO的酶促反應最適溫度從溶液狀態(tài)時的27℃提高到固定化后的30℃，可表現出高活性的溫度條件范圍相應擴大(27