聚乳酸單體L-乳酸由米根霉固定化發(fā)酵玉米秸稈水解物的生產研究.pdf

1、生物材料聚乳酸是受到廣泛關注的生物相容性良好和全生物降解材料，由乳酸聚合而成。如果聚乳酸單體乳酸能夠從廉價的生物質資源通過生物煉制轉化而來，則無論對醫(yī)學發(fā)展、環(huán)境保護還是資源節(jié)約都具有重要意義。乳酸是基本的有機酸之一，是一種重要的平臺化合物，實現生物煉制生產也是未來生物基經濟代替石油基經濟的重要產業(yè)組成。要實現生物煉制生產乳酸目前尚有一些技術瓶頸需要被攻克，最主要的有兩點，一是將木質纖維素原料低成本、高效率的轉化成可生物利用的小分子糖類

2、；二是生物發(fā)酵纖維素來源的糖類高效轉化生產乳酸。目前該領域的技術積累還不能完全滿足大規(guī)模的工業(yè)化生產，相關產業(yè)的經濟效益還不能與以石油為基礎的產業(yè)相比。本研究將針對這兩大技術瓶頸，圍繞農作物秸稈木質纖維素的高效糖化技術、米根霉固定化發(fā)酵生產乳酸等內容展開研究。
　　我國是農業(yè)大國，農作物秸稈資源豐富，在各類秸稈資源中尤其以玉米秸稈最為豐富。如何提高玉米秸稈的糖化效率是利用該資源進行生物煉制，用于生產平臺化合物的關鍵。在利用纖維素酶

3、水解玉米秸稈纖維素生產葡萄糖的過程中，秸稈的致密結構是酶解β-1,4-糖苷鍵的主要障礙，本研究中我們采用蒸汽爆破技術對木質纖維素結構進行破壞，以提高纖維素酶解效率。
　　在蒸汽爆破預處理玉米秸稈的研究中，以酶解還原糖產率為響應值，采用均勻實驗設計得到最佳汽爆工藝條件，即汽爆壓力2.2MPa、液固比1:1、維壓時間9min、物料顆粒度40-60目。在此工藝條件下酶解還原糖產率是未處理原料的1.97倍?；瘜W組分分析顯示，蒸汽爆破處理后

4、秸稈物料中纖維素含量及木質素含量相對于原料分別增加了29.73％和19.65%，說明通過蒸汽爆破預處理能夠提高秸稈物料中纖維素的相對含量。SEM觀察可見，蒸汽爆破處理后其結構破壞明顯，表面出現褶皺，結構變的蓬松，比表面積增大。
　　以優(yōu)化工藝對玉米秸稈進行蒸汽爆破預處理，然后進行水/醇抽提處理，將纖維素、半纖維素和木質素等組分進行分離，進一步提高纖維素酶的可及性。對底物濃度、纖維素酶用量、酶解反應時間等因數采用單因素分析和響應面分

5、析實驗進行工藝優(yōu)化。以酶解還原糖產率為響應值，對回歸方程求解得到的最佳工藝條件為：底物濃度53.28g/L，纖維素酶用量53.32FPU/g，酶解時間60.45h，此工藝條件下還原糖產率的最大預測值為694.11mg/g。經過試驗驗證，得到酶解后還原糖產率為672.36mg/g，與模型預測結果接近。在相同酶解工藝條件下，經過蒸汽爆破-水/醇處理后物料酶解還原糖產率較原料提高了170.46%，較單純蒸汽爆破后物料提高了28.97%?；瘜W組

6、分分析顯示，水/醇處理能有效分離纖維素、半纖維以及木質素，進一步提高物料中的纖維素含量，SEM圖譜也顯示水醇處理使秸稈物料的結構變的更加的蓬松，這些因素可有效增加纖維素酶對纖維素的可及性，提高了酶解效率。
　　為了克服絲狀真菌發(fā)酵過程中細胞形態(tài)不易控制，機械運動易造成菌絲斷裂損傷；會形成大的菌絲團，阻礙氧氣和營養(yǎng)物質的傳遞等不利生產的特點。對米根酶固定化發(fā)酵技術進行了研究，包括固定界面的選擇、固定支架的設計以及固定化效果的評價。并

7、利用玉米秸稈水解物為主要碳源，篩選出適合利用水解物發(fā)酵產酸的米根霉菌種，采用固定化發(fā)酵技術進行了搖瓶和反應器發(fā)酵生產乳酸的研究，優(yōu)化了發(fā)酵工藝。
　　通過多種米根霉和乳酸桿菌發(fā)酵產乳酸的比較，篩選出米根霉As3.3462菌種是適合發(fā)酵玉米秸稈酶解物生產乳酸的菌種。為了制作出適合米根霉固定化發(fā)酵的固定支架，試驗篩選出棉布是用于米根霉固定的良好纖維表面，六角星形載體菌絲層層固定后仍具有較大的表面積，多棱角的結構使菌絲層內部具有較好的物

8、質傳輸特性，適合菌體生長和產酸。通過孢子固定動力學的研究發(fā)現，米根霉孢子能完全固定在載體上，隨著菌絲的生長，吸附率急劇上升。通過對孢子固定動力曲線的數學擬合，發(fā)現孢子的吸附符合一級反應動力學特征。載體尺寸、數量與反應器容量以及孢子接種量間對于菌體生長和乳酸生產存在最佳比例關系。通過100mL的搖瓶實驗，直徑2.5cm、3個載體、1×106/mL的孢子接種濃度對菌體生長和乳酸生產最為有利。
　　進一步研究As3.3462米根霉固定化

9、發(fā)酵玉米秸稈水解物生產L-乳酸。為了了解米根霉對玉米秸稈水解物的代謝特性，分別研究米根霉對葡萄糖和木糖的代謝，揭示木糖代謝的磷酸戊糖途徑乳酸轉化率低，但能有效提高生物量，以玉米秸稈水解物發(fā)酵生產乳酸主要通過葡萄糖代謝轉化。通過葡糖糖和木糖混合模擬玉米秸稈水解物，從糖消耗的動力學分析，米根霉優(yōu)先消耗葡萄糖，對木糖的消耗需要經歷一段時間的“適應性”調整，乳酸生成主要在葡萄糖消耗階段。玉米秸稈水解物包含22.8%的葡萄糖和27.2%的木糖，其

10、發(fā)酵動力學特點與1:1的混糖模擬類似。隨著葡萄糖被迅速消耗，木糖的消耗速度逐漸提高，發(fā)酵176h時乳酸生產水平達到最大15g/L，轉化率約30%，整個過程伴有乙醇的生成。在單因素分析的基礎上，通過均勻設計優(yōu)化了同步糖化發(fā)酵，使糖化和發(fā)酵過程良好耦合，秸稈轉化率接近15%。
　　采用本室自行設計制作的鼓泡式生物反應器，對米根霉固定化發(fā)酵的工藝進行了放大研究?？疾炝朔磻髦墟咦拥奈胶兔劝l(fā)狀況，結果顯示，通氣對孢子固定具有干擾作用，在

11、0.5vvm的通氣量下需要10h萌發(fā)的孢子才能全部固定。通過對菌絲層的通氣特性分析顯示，菌絲層厚與氧氣傳輸速率間非線性，超過15mm的臨界厚度，菌絲層會嚴重阻礙氧的傳輸，提示固定發(fā)酵的菌絲層厚要控制在15mm的范圍內。通過比較固定發(fā)酵和游離發(fā)酵，前者乳酸轉化率可以達到72%，而后者只有40.4%，固定發(fā)酵顯著優(yōu)于游離發(fā)酵。同時進行了重復批次發(fā)酵和同步糖化發(fā)酵的研究，重復批次發(fā)酵可以連續(xù)發(fā)酵6批次，乳酸轉化率保持在40%以上，同步糖化發(fā)酵

12、可以達到57%的轉化率。
　　綜上所述，為了有效的將玉米秸稈纖維素轉化成 L-乳酸，我們對玉米秸稈的物理和化學的預處理技術、生物酶解糖化技術進行了系統(tǒng)研究，建立了一種成本低、環(huán)境污染小、效率高的玉米秸稈木質纖維素糖化技術，為玉米秸稈資源用于生物煉制奠定了基礎。接著以米根霉發(fā)酵玉米秸稈水解物生產 L-乳酸為目的，篩選出了適合發(fā)酵產酸的米根霉菌種 As3.3462，通過比較發(fā)現米根霉對葡萄糖和木糖轉化途徑的差異性，為有效利用秸稈資源提

13、出了新思路。通過不同性質的材料對比篩選出適合米根霉固定的纖維材料，以增大表面積、提高菌團內部物質傳輸為目的，設計出了一種具有優(yōu)化幾何形狀的固定化載體，并用于玉米秸稈水解物的固定化發(fā)酵研究。根據該固定化特點，設計制作了鼓泡式生物反應器用于工藝放大研究，通過建立氣竄實驗模型，分析了玉米秸秸稈水解物發(fā)酵液中的溶氧特性和菌絲層中溶氧傳輸特性，確定了反應器通氣控制。利用優(yōu)化的工藝進行補料分批發(fā)酵和同步糖化發(fā)酵試驗，證實該固定化發(fā)酵技術具有較好的穩(wěn)